整个肝脏的脱细胞和Recellularization

摘要

灌注脱细胞是一种新型的的技术来生产全肝支架，保留器官的细胞外基质成分和微。在这里，准备灌注脱细胞与肝细胞和后续复育的整个器官支架的方法描述。使用这种技术，可以生成功能和移植肝移植。

摘要

肝脏是一个复杂的器官，这就需要不断提供营养和氧气和废物清除灌注为了^生存 1 。努力重建或模仿肝脏显微结构与向上的方法，利用组织工程和微细加工技术的理由都没有成功至今，由于这一设计挑战。此外，用于创建为肝组织工程中的应用支架的合成生物材料由于缺乏特定的细胞结合的图案，将^促使正常的细胞功能2，在诱导组织再生和修复在很大程度上受到了限制。脱细胞原生组织，如血管³和皮肤⁴另一方面发现在组织工程中的许多应用，并提供了一个切实可行的解决办法的一些挑战。脱细胞原生基质的优点是，它保留了，在一定程度上，原来的组成和微观结构，从而增强细胞附着^和重组5。

在这项工作中，我们描述的方法来执行灌注脱细胞的肝脏，这样一个完整的肝bioscaffold保留主要血管的结构得到。此外，我们描述recellularize与成人原发性肝细胞的这些bioscaffolds，创造了肝移植，体外功能的方法，和体内移植所需的船只。

研究方案

1。肝脱细胞

1. 大鼠肝门静脉插管和18号导尿管收获。让劣势和上腔静脉开放。器官的水分保持在磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的一个10厘米的培养皿中。
2. 设置灌注系统，包含8升水库，蠕动泵和泡沫陷阱。
3. 填写灌注系统，用磷酸盐缓冲液，保持10分钟运行。填写成10厘米的培养皿中的PBS和减少流量的磷酸盐缓冲生理盐水1毫升/分钟。
4. 仔细收获肝脏转移到磷酸盐缓冲生理盐水填充10厘米的培养皿。
5. 继续用PBS灌注过夜。
6. 开始灌注0.01％（W / V）十二烷基硫酸钠（SDS），蒸馏水5分钟。
7. 用PBS灌注1小时。
8. 重复步骤1.6和1.7三个次以上，每次增加10，15和20分钟SDS灌注时间。
9. 继续灌注24小时为0.01％（W / V）SDS。
10. 继续0.1％（W / V）SDS灌注24小时。
11. 与0.2％（W ​​/ V）SDS灌注3小时。
12. 与0.5％（W / V）SDS灌注3小时。
13. 用蒸馏水灌注15分钟。
14. 1％（W / V）蒸馏水海卫在X - 100的灌注30分钟，以消除任何约束的核酸。
15. 洗脱细胞肝矩阵（DLM），2小时，用PBS灌注。
16. 可选：除位数肺叶切除所有的肺叶。
17. 在PBS浸泡在摄氏⁴度，直到准备使用（图1）在清洁和密封的Petri菜店的DLM的。
18. 要消毒的DLM：1）用无菌PBS包含在摄氏⁴度0.1％（V / V）过氧乙酸和4％（V / V）乙醇和3个小时的孵化的冲洗DLM 2）用无菌PBS的2倍。 3）用无菌PBS含2％的青霉素，链霉素，庆大霉素10ug /毫升和2.5微克/毫升两性霉素B店在摄氏⁴度相同的解决方案，直到准备使用recellularization实验脱细胞肝。

2。 Recellularization的脱细胞肝基质

1. 设置灌注系统灌注室，蠕动泵和无菌条件下的泡沫陷阱。装满200毫升培养基，例如，高糖DMEM（Sigma公司），10％胎牛血清（Hyclone公司），100 U毫升^-1青霉素，100微克毫升^-1链霉素（Invitrogen）的灌注系统。
2. 将脱细胞肝脏灌注室矩阵和连接的DLM，门静脉插管灌注系统，而泵运行在5毫升/分钟，以避免任何气泡的形成。
3. 允许通过30分钟的DLM的灌注介质。
4. 隔离与至少90％的可行性的成年大鼠原代肝细胞。
5. 停止灌注系统的流量，慢慢注入灌注系统，通过50万肝泡沫陷阱（1-3毫升培养基）。
6. 开始于10毫升/分钟的流量循环10分钟的中等。
7. 重复步骤2.5和2.6，共有200万个单元格，直到DLM（图^2）6 。
8. 一旦所有的细胞都灌注到DLM的，收集到4个50 mL离心管和离心10分钟600转的灌流。丢弃上清液，收集到一个单一的管的颗粒。确定细胞，并通过台盼蓝拒确定播种效率的可行性。

3。Recellularized移植肝脏离体培养

1. 成立了灌注系统灌注室，蠕动泵，氧合和无菌条件下（图3）的泡沫陷阱。填写与50毫升培养液灌注系统，例如，威廉姆斯“E（Sigma公司），5％胎牛血清（Hyclone公司），0.5 U毫升^-1胰岛素（礼来），20纳克毫升^-1 EGF（Invitrogen公司） 14纳克毫升^-1胰高血糖素（贝德福德实验室），7.5微克毫升^-1氢化可的松（Pharmacia公司），100 U毫升^-1青霉素，100微克毫升^-1链霉素（Invitrogen公司）。
2. 放置在灌注室recellularized肝移植和连接的DLM，门静脉插管灌注系统，而泵运行在5毫升/分钟，以避免任何气泡的形成。
3. 无菌关闭灌注室和密封紧密，以避免任何文化过程中的泄漏。
4. 灌注系统转移到一个孵化器，是^37℃和10％CO _2，增加灌注流量为15毫升/分钟。
5. 连接氧合95％O ₂和5％的CO ₂混合气体罐和气体流量设置为0.5升/分钟。这应该实现一个近似的氧分压tely 400毫米汞柱。
6. 文化可能会持续长达10天的每日变动与培养基。培养基可每天进行采样监测肝功能的嫁接，如白蛋白，尿素和总胆汁酸的分泌。在文化时期的结束，recellularized肝移植可能是采样的分子和组织学分析。

4。代表性的成果：

完成脱细胞的老鼠的肝脏大约需要72小时，使用所描述的协议。结果矩阵保留100％的纤维状的胶原蛋白，50％的粘多糖，只有5％的原生肝DNA（ 表^1）6。矩阵的血管结构保存腐蚀铸造和扫描电子显微镜分析（图^4）6证明。 DLM的血管内微架构的存在有利于它的复育与96％ 的效率和其在体外培养的后续灌注细胞。 recellularized肝移植可能培养10天的体外 ，并显示适当的肝功能确认通过白蛋白，尿素和总胆汁酸的分泌（图^5）6。

图1。肝基质脱细胞在脱细胞过程的结束。 （一）（二）全肝切除后的中位叶。

图2。recellularization的DLM的示意图。

图3。灌注recellularized肝移植的体外培养系统设置。

图4。微血管结构被保留在脱细胞肝基质。腐蚀铸一）正常肝脏B）一个脱细胞肝，门户网站（红色）和静脉（蓝色）血管的图像。扫描电子显微镜图像的DLM的C的）船，D）的部分胆管般的小血管（箭头），比例尺（A，B）5毫米（C，D）20微米。

图5。recellularized肝移植肝特异性功能， 在体外灌注培养。一）白蛋白的分泌（P = 0.5249），B）的尿素产量（P = 0.5271）和C），总胆汁酸的分泌（P = 0.0114）。统计分析实验和控制之间的区别做了10天的文化时期，弗里德曼在= 0.01的测试。误差棒代表SEM（N = 3）。

	新鲜livera	脱细胞肝矩阵 A	P -值	鲜猪肝％
	N = 4	N = 8
胶原	0.07 ± 0.01	0.08 ± 0.03	0.56	114％
（每克肝毫克）
粘多糖	73.1 ± 6.7	34.2 ± 2.9	0.004	47％
（每克肝毫克）
的DNA	14.9 ± 5.6	0.44 ± 0.08	3.3 10-5	2.9％
（每克肝毫克）

表1。生化成分的脱细胞肝基质相比，原生肝。
^一个数值表示为平均± SEM

讨论

这里描述灌注脱细胞方法产生一个全肝支架具有相同的总体结构和原生肝血管微架构。支架有一个类似的原生的肝细胞外基质组成。 recellularization方法实现高效率和细胞的细胞仍然在测试期间在体外培养可行和功能的支架复育。到recellularized移植肝非实质细胞此外，我们设想，可作为一个平台，用于研究药物代谢，再生和发展，如各种肝功能的recellularized肝移植。此外，可能会发现recellulariz...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149