Decellularization e Recellularization di fegati interi

Riepilogo

Decellularization perfusione è una tecnica innovativa per la produzione di ponteggi fegato intero che conserva la composizione della matrice extracellulare l'organo e la microarchitettura. Qui, il metodo di preparazione di ponteggi intero organo utilizzando decellularization perfusione e conseguente ripopolamento con epatociti è descritto. Trapianti di fegato funzionale e trapiantabili possono essere generati utilizzando questa tecnica.

Abstract

Il fegato è un organo complesso che richiede perfusione costante per la consegna di sostanze nutritive e di ossigeno e la rimozione dei rifiuti per sopravvivere ^1. Gli sforzi per ricreare o imitare la microstruttura fegato con motivi up utilizzando l'ingegneria dei tessuti e le tecniche di microfabbricazione non hanno avuto successo finora a causa di questa sfida di design. Inoltre, biomateriali sintetici utilizzati per creare impalcature per le applicazioni di tessuto epatico di ingegneria sono stati limitati nell'indurre la rigenerazione dei tessuti e la riparazione in gran parte a causa della mancanza di motivi specifici delle cellule vincolante che avrebbe indotto le funzioni cellulari corretta ^2. Tessuti Decellularized nativo vasi sanguigni della pelle come ³ e ⁴ invece hanno trovato molte applicazioni in ingegneria dei tessuti, e hanno fornito una soluzione pratica per alcune delle sfide. Il vantaggio di matrice decellularized nativa è che si conserva, in una certa misura, la composizione originale e la microstruttura, migliorando quindi l'attaccamento delle cellule e riorganizzazione ^5.

In questo lavoro si descrivono i metodi per eseguire perfusione-decellularization del fegato, come ad esempio che un fegato intatto bioscaffold che mantiene la struttura dei vasi sanguigni principali si ottiene. Inoltre, si descrivono i metodi per recellularize questi bioscaffolds con adulti epatociti primari, la creazione di un trapianto di fegato che è funzionale in vitro, ed ha l'accesso nave nella misura necessaria per il trapianto in vivo.

Protocollo

1. Fegato Decellularization

1. Raccolto un fegato di ratto con incannulazione della vena porta e con 18-gauge catetere. Lasciare l'inferiore e vena cava superiore aperto. Mantenere l'organo idratata in tampone fosfato (PBS) in una di 10 cm capsula di Petri.
2. Istituire un sistema di perfusione costituito da serbatoio da 8 litri, pompa peristaltica e un gorgogliatore.
3. Riempire il sistema di perfusione con tampone fosfato e mantenerlo in funzione per 10 minuti. Riempire PBS in una di 10 cm capsula di Petri e di ridurre la portata di tampone fosfato a 1 ml / min.
4. Trasferire accuratamente l'fegato raccolte al tampone fosfato pieno di 10 cm capsula di Petri.
5. Continuare con perfusione PBS durante la notte.
6. Inizio perfusione con 0,01% (w / v) dodecil solfato di sodio (SDS) in acqua distillata per 5 minuti.
7. Profumato con PBS per 1 ora.
8. Ripetere i passi 1,6 e 1,7 per altre tre volte aumentando il tempo di perfusione SDS a minuti 10, 15 e 20 in ciascun momento.
9. Continua perfusione con 0,01% (w / v) di SDS per 24 ore.
10. Continua perfusione con 0,1% (w / v) di SDS per 24 ore.
11. Profumato con il 0,2% (w / v) di SDS per 3 ore.
12. Profumato con il 0,5% (w / v) di SDS per 3 ore.
13. Profumato con acqua distillata per 15 minuti.
14. Profumato con l'1% (w / v) Triton X-100 in acqua distillata per 30 minuti per eliminare gli acidi nucleici legati.
15. Per lavare il fegato decellularized matrice (DLM), profumato con PBS per 2 ore.
16. Opzionale: resecare tutti i lobi, tranne il lobo mediano.
17. Conservare il DLM in un piatto pulito e sigillato Petri immersi in PBS a 4 ^° C fino al momento dell'uso (Figura 1).
18. Per sterilizzare l'DLM: 1) Lavare il DLM con PBS sterile contenente 0,1% (v / v) e acido peracetico al 4% (v / v) di etanolo e incubare per 3 ore a 4 ^° C. 2) Lavare con PBS sterile 2 volte. 3) Lavare con PBS sterile contenente 2% di penicillina-streptomicina, 10ug / mL di gentamicina, e 2,5 ug / ml di amfotericina B. Conservare il fegato decellularized nella stessa soluzione a 4 ^° C fino al momento dell'uso per esperimenti recellularization.

2. Recellularization di Decellularized Fegato Matrix

1. Istituire un sistema di perfusione costituito da una camera di perfusione, pompa peristaltica e un gorgogliatore in condizioni sterili. Riempire il sistema di perfusione con 200 ml di terreno di coltura, per esempio, elevata glicemia DMEM (Sigma), 10% siero fetale bovino (Hyclone,), 100 U ml ^-1 penicillina, e 100 mg ml ^-1 streptomicina (Invitrogen).
2. Posizionare la matrice decellularized fegato nella camera di perfusione e collegare il DLM al sistema di perfusione attraverso la cannula vena porta, mentre la pompa è in funzione a 5 mL / min per evitare la formazione di eventuali bolle d'aria.
3. Lasciare perfusione del mezzo attraverso il DLM per 30 minuti.
4. Isolare epatociti primari di un ratto adulto con almeno il 90% vitalità.
5. Fermare il flusso nel sistema di perfusione e iniettare lentamente 50 milioni epatociti (in mL 1-3 su terreno di coltura) nel sistema di perfusione attraverso il gorgogliatore.
6. Avviare il flusso a 10 ml / min e ricircolo del mezzo per 10 minuti.
7. Ripetere i passi 2.5 e 2.6 fino a un totale di 200 milioni di cellule vengono introdotti nel DLM (Figura 2) ^6.
8. Una volta che tutte le cellule sono perfusi in DLM, raccogliete il perfusato in quattro da 50 ml, provette da centrifuga e centrifugare a 600 giri per 10 minuti. Eliminare il surnatante e raccogliere il pellet in un unico tubo. Determinare il numero di cellule e vitalità attraverso l'esclusione trypan blu per determinare l'efficienza semina.

3. Coltura in vitro del trapianto di fegato Recellularized

1. Istituire un sistema di perfusione costituito da una camera di perfusione, pompa peristaltica, ossigenatore ed un gorgogliatore in condizioni sterili (Figura 3). Riempire il sistema di perfusione con 50 ml di terreno di coltura, per esempio, Williams 'E (Sigma), il 5% siero fetale bovino (Hyclone,), 0,5 U di insulina mL ^-1 (Eli Lilly), 20 ng mL ^-1 FEG (Invitrogen) , 14 ng mL ^-1 glucagone (Bedford Laboratories), 7,5 ml mg di idrocortisone ^-1 (Pharmacia), 100 U ml ^-1 penicillina, e 100 mg ml ^-1 streptomicina (Invitrogen).
2. Posizionare il trapianto di fegato recellularized nella camera di perfusione e collegare il DLM al sistema di perfusione attraverso la cannula vena porta, mentre la pompa è in funzione a 5 mL / min per evitare la formazione di eventuali bolle d'aria.
3. Asetticamente chiudere la camera di perfusione e sigilla ermeticamente per evitare perdite durante cultura.
4. Trasferire il sistema di perfusione di un incubatore che è 37 ^° C e ha il 10% di CO ₂ e aumentare il tasso di flusso di perfusione a 15 ml / min.
5. Collegare l'ossigenatore ad un 95% di O ₂ e il 5% di CO ₂ Serbatoio miscela di gas e di impostare la velocità di flusso del gas di 0,5 litri / min. Questo dovrebbe raggiungere una pressione parziale di ossigeno di approssimazionetely 400 mmHg.
6. La cultura può continuare fino a 10 giorni, con variazioni giornaliere di terreno di coltura. Il terreno di coltura può essere campionato al giorno per il monitoraggio delle funzioni del fegato del trapianto, come l'albumina, urea e totale secrezione degli acidi biliari. Al termine del periodo di cultura, il trapianto di fegato recellularized possono essere prelevati per analisi molecolari e istologiche.

4. Rappresentante dei risultati:

Il decellularization completa di un fegato di ratto è di circa 72 ore utilizzando il protocollo descritto. La matrice risultante mantiene il 100% del collageno fibrillare, il 50% dei glicosaminoglicani e solo il 5% del DNA del fegato nativo (Tabella 1) ^6. La struttura vascolare della matrice è conservato come evidenziato dalla corrosione casting e analisi microscopia elettronica a scansione (Figura 4) ^6. La presenza della microarchitettura vascolare all'interno del DLM facilita il suo ripopolamento con celle con un'efficienza del 96% e la sua perfusione successive per coltura in vitro. Il trapianto di fegato recellularized può essere colta fino a 10 giorni in vitro e visualizza le funzioni del fegato corretto come confermato via albumina, urea e totale secrezione degli acidi biliari (Figura 5) ^6.

Figura 1. Decellularized matrice fegato al termine del processo di decellularization. (A) il fegato intero (b) il lobo mediano dopo la resezione.

Figura 2. Rappresentazione schematica della recellularization del DLM.

Figura 3. Configurazione del sistema di perfusione per coltura in vitro del trapianto di fegato recellularized.

Figura 4. La struttura microvascolare viene mantenuta nella matrice fegato decellularized. Fusione di immagini corrosione a) un fegato normale b) una decellularized fegato, portale (rosso) e venoso (blu) vascolare. Microscopia elettronica a scansione di immagini del DLM c) una nave, d) una sezione con i piccoli vasi del dotto biliare-like (frecce), bar Scala (a, b) 5 mm (c, d) 20 micron.

Figura 5. Fegato funzioni specifiche del trapianto di fegato recellularized durante la perfusione nella cultura in vitro. a) la secrezione di albumina (p = 0,5249), b) produzione di urea (p = 0,5271) e c) totale di acidi secrezione biliare (p = 0,0114). L'analisi statistica della differenza tra l'esperimento e il controllo è stato fatto nel periodo 10 cultura d dal test di Friedman per a = 0,01. Barre di errore rappresentano sem (n = 3).

	Fresco Livera	Decellularized fegato matrice A	valori di p	% Di fegato fresco
	n = 4	n = 8
Collagene	0,07 ± 0,01	0,08 ± 0,03	0,56	114%
(Mg per g di fegato)
Glicosaminoglicani	73,1 ± 6,7	34,2 ± 2,9	0,004	47%
(Mg per g di fegato)
DNA	14,9 ± 5,6	0,44 ± 0,08	3.3 10 -5	2,9%
(Mg per g di fegato)

Tabella 1. La composizione biochimica della matrice fegato decellularized rispetto al fegato nativo.
^{a I} valori sono rappresentati come media ± sem

Discussione

Il metodo di perfusione decellularization qui descritto produce una intera impalcatura del fegato che ha la stessa struttura lordo e la microarchitettura vascolare del fegato nativo. Il ponteggio ha una composizione simile a quello della matrice extracellulare del fegato nativo. Il metodo recellularization raggiunge ripopolamento del patibolo con celle ad alta efficienza e le cellule rimangono vitali e funzionali durante il periodo di coltura in vitro testati. Con l'aggiunta di cellule nonparenchymal nel tr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149