建模在小鼠体内的行程 - 中东与灯丝模型大脑中动脉闭塞

摘要

丝状的大脑中动脉闭塞，是一个研究小鼠缺血性中风的常见模型。

摘要

中风是之间的死亡和残疾成人，尤其是在高度发达的国家，最常见的原因。然而，迄今为止的治疗方案是非常有限的的。为了满足新的治疗方法需要，中风的实验研究经常采用局灶性脑缺血啮齿动物模型。大多数研究人员使用的小鼠或大鼠大脑中动脉（MCA）的永久或暂时闭塞。

通过腔内缝合技术（所谓长丝或缝合模型）（MCA）的大脑中动脉近端闭塞可能是实验性中风的研究中最常用的模型。腔内MCAO模型提供了在一个相对非侵入性的方式重现短暂或永久MCA的领土缺血诱导的优势。腔内的方法中断的整个领土的这个动脉的血流量。因此，长丝闭塞逮捕流近端lenticulo纹动脉，供应基底节。长丝闭塞，在皮层和纹状体的重现性病变MCA的结果可以是永久或短暂。相比之下，MCA闭塞模型，诱导远端（lenticulo纹动脉分支）通常备用纹状体和主要涉及的大脑皮层。此外，这些模型需要去骨瓣。本文演示模型，硅涂层长丝引入左颈总动脉和先进的威利斯，它阻断大脑中动脉的起源圈沿颈内动脉。大脑中动脉闭塞的患者，是缺血性中风的最常见的原因。由于不同缺血时间间隔可自由选择在这个模型再灌注时间点上，可以产生不同程度的缺血性病变。再灌注去除咬合长丝至少部分模型自发或治疗（TPA）在人类的血栓栓塞血块溶解后恢复血液流动。

在这个视频中，我们将目前的基本技术以及主要缺陷和混杂因素，这可能会限制这个模型的预测值。

研究方案

为了保证高质量和可重复性，我们建议使用的标准操作程序（SOP）。在这个视频，发表在我们的实验室开发和使用的SOP应用¹

1。大脑中动脉闭塞

1. 小鼠与咨询兽医人员适当的麻醉制度麻醉。 （如诱导1.5 - 2％异氟醚和维护1.0 - 1.5％异氟醚2 / 3的N2O和1 / 3的氧气使用喷雾器）。
   1. 小鼠的体温保持在36.5 ° C ± 0.5 ° C在一个加热板手术。强烈建议，根据鼠标的直肠温度变暖的反馈控制的加热垫。
   2. 一个合适的代理（如70％酒精）消毒的皮肤和周围的皮毛和事后干燥。
2. 中线颈部切口及软组织拉开。
3. 左颈总动脉（LCCA）仔细解剖周围神经（不伤及迷走神经）和结扎是使用6.0/7.0字符串。也可用于5.0字符串。
4. 然后分离左侧颈外动脉（莱萨）和第二个结。
5. 接下来是孤立的，左侧颈内动脉（LICA）和6.0长丝准备了一个结。
6. 左侧颈内动脉（LICA）和左侧翼腭动脉（LPA）获得良好的查看后，两动脉被裁剪，使用微血管剪辑。
7. 之前，分叉的莱萨和LICA在LCCA切开一个小孔。然后引入一个单丝涂有硅固化剂混合物（见下文）的8.0尼龙LICA，直到它停在剪辑。要注意支付不进入枕动脉。 （图1）
8. 剪切的动脉被打开，而灯丝插入到LICA闭塞Willis环的原产地的LMCA。
9. 第三个结对LICA封闭，固定位置的灯丝。
10. 小鼠接受生理盐水0.5毫升皮下注射量补货。缓解疼痛，利多卡因凝胶是在伤口局部应用。
11. 如果再灌注的目的是，老鼠留30 - 90分钟在激烈的笼子闭塞，可以封闭伤口，用一个小的缝合片段。之后，进行第二次麻醉，结对ICA第三是瞬间打开灯丝撤回。
12. 剩余的缝线缩短，适应与手术缝合皮肤。
13. 所有的动物都收到如上所述，第二卷补货。
14. 动物都放在了两个小时，体温控制在激烈的笼子。
    1. 动物必须每天检查，手术后不适的迹象。小鼠可能会​​表现出一定的手术减肥后。他们收到捣碎食物，在培养皿，培养皿放置在地板上，鼓励进食。七天每天食物取代。

2。假手术

1. 深水作业的灯丝是插入到闭塞LMCA立即取消允许即时再灌注（1.8）。随后的操作是相同的，发生脑缺血（1.9 - 1.14）的动物，包括第二次麻醉。

3。灯丝的制备

1. 应考虑灯丝不育。事后使用消毒设备，以及适当处理灯丝是无菌手术的先决条件。消毒的灯丝是困难的，因为许多常见的灭菌方法可能会恶化长丝的质量。然而，如辐射的方法，例如紫外线或γ射线，或化学灭菌，例如高活性气体，如环氧乙烷，都适用。
2. 8.0锦纶长丝被切成长度为11毫米，在显微镜下
3. 灯丝尖端必须超过8毫米的长度，完全并均匀地涂固化剂混合物的Xantopren中号黏膜和激活的NF Optosil

4。代表性的成果

血流量限制的期限，根据不同的电机和行为缺陷的结果。两个后30和脑缺血60分钟，在大多数情况下，动物抵抗力下降，横向推盘旋在运动障碍。温和的病变表现为一个在前面的李屈位置MBS。这些很容易观察到的迹象，可以用来作为手术成功的基本得分。

形态病变可使用或者组织学或磁共振成像（MRI）进行评估。六十分钟大脑中动脉闭塞，生产面积包括纹状体和大脑皮层组织pannecrosis，而30分钟，缺血引起主要限于纹状体的神经细胞死亡^。梗死体积3（图2） ，我们预期标准偏差低于30％的一组操作。死亡率取决于阻断时间约5％后，30分钟缺血和10 - 60分钟后的20％。

另一种微创的可能性是使用激光多普勒血流计（LDF）的操作过程中，允许其成功的直接控制。在一个单个的动物，减少到10 - 20％preocclusion值明确表示局灶性脑缺血的成功^归纳4然而，自卫队可以不被作为个体间的比较的方法使用，因为自卫队可以只测量定量的变化血（百分比）。流内的一个小而有限的组织样本量。它不给的血流量减少的空间范围的信息。

有几种测试，以评估中风后的行为方面，包括步态分析^{6,7，Rotarod 8，}极测试^9,10，不干胶去除测试^{11,12，13,14}楼梯测试，梯级测试^15,16和Morris水迷宫^17。在所有这些测试中，受到缺血的小鼠比对照组动物执行较为成功。

图1。船只提供在小鼠大脑的架构（背景描绘）的计划。不同菌株可能会出现变化，例如的枕动脉，有时叶片颈内动脉。

图2。近端MCAO模型再灌注后不同时间点的典型病变大小的示意图。在中间，功能活动和脑血流量MCAO后的典型当然是描绘。 （MCAO：大脑中动脉闭塞，LDF激光多普勒血流测量）

讨论

短暂的^，18,19近端MCA闭塞模型，介绍了这里的模拟缺血性中风患者最常见的类型^之一 。20变量灌注时间的基础上，该模型提供了不同档次的损害，从短暂性脑缺血发作（ TIA）到大不等包括主要部件的缺血半球梗死。这使研究人员研究中风后不同的病理生理机制^。 20,21

手术可以在很短的时间内，生产高度重复性病变。不过，这需要彻底控制了混杂因素^。22在操作技术的细微差别可能占不同的效果梗死^。23,24此外，由于脑血管解剖的差异，不同的小鼠品系表现出不同的^结果 。 25,26机构温度影响，低温导致较小的病灶²⁷和热疗，更严重的赤字的神经^损伤 ，28因此，温度控制和维护在这个模型是高度相关^的 。29此外，血压和血气结果的重要混杂因素和需要^30,31快速，微创方法的使用（非侵入性血压测量，适合和容易访问的采血网站）进行监测。建议。麻醉剂的选择也是非常重要的，因为有些人可能有保护作用，和/或血管扩张剂，例如异氟^醚 32因此，接触麻醉应尽可能和规范化。我们排除经历了手术时间超过15分钟的动物。

剃须手术部位产生microabrasions和炎症，并释放头发片段。这可能会进一步加重炎症和促进当地的感染，这可能会影响中风的病理生理。住房条件，特别是使用浓缩，可能会影响中风的结果，并应标准化，并在研究报告^中描述的。6,33,34使用环境的丰富和重复性其效果是^一个讨论的问题。35另一个重要混杂因素是中风引起的感染的风险，特别是经过较长时间^的缺血36的，这会导致额外的发病^率和死亡率增加。37,38感染症状在3至5天左右，这已长期在这种模型的后续行动的重要后果。

产生结果，为发展新的治疗中风，标准化和质量控制策略有关，是非常重要的翻译中风在临床^前研究39“良好实验室^规范 ”40,41任务。

1. 使用动物的适当和详细的描述;
2. 样本量的计算和报告预期的效果大小;
3. 纳入和排除标准，之前设置的研究;
4. 随机的分配到组;
5. 分配隐蔽性调查;
6. 报告从分析中排除的动物;
7. 盲法评估的结果;
8. 报告潜在的利益冲突和研究经费。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical scissors (skin cut)	Fine Science Tools	14028-10
2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip)	Fine Science Tools	11253-20
Spring scissors (according to Vannas)	Fine Science Tools	15000-00
Applying forceps for micro clamps	Fine Science Tools	00072-14
Micro vascular clamp (e.g. S&G B1-V)	Fine Science Tools	00396-01	Also Serrefine possible
2 Hemostats according to Hartmann	Fine Science Tools	13002-10
Needle holder (according Olsen-Hegar or other)	Fine Science Tools	12002-14
Standard anatomical forceps (for wound closure)	Fine Science Tools	11000-12
5/0 sutures	Suprama		for vascular ligatures
6/0 sutures	Suprama		for skin suture, 5/0 also possible
Lidocaine (e.g. Xylocain Gel 2%)	AstraZeneca		or other local pain relief
Dissecting microscope (stereo microscope), magnification 6x to max. 40x	Leica Zeiss	MZ6 Stemi2000C
Cold light source	Leica Microsystems	KL1500
Temperature feedback controlled heating pad system	Fine Science Tools	21052-00	With mouse pad and small probe
Anaethesia system for isoflurane
Isoflurane	Abott
Veterinary Recovery Chamber	Peco Services	V1200	Heated cage
8.0 nylon filament	Suprama	TEL181005	for coating
Scalpel			For cutting filament in pieces
Ruler			To cut correct length of filament
Xantopren M Mucosa	Heraeus Instruments
Activator Universal Plus	Heraeus Instruments		Optosil - Xantopren
2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip)	Fine Science Tools	11253-20
A soft underlay for storing and grasping the uncoated filaments			e.g. swabs, foam, …
Receptacle for new build filaments			e.g. petri dish, flexible foam,…