免疫细胞在受伤的脊髓组织流式细胞仪定量评估：一个细胞的分离纯化方法的新颖使用

摘要

在流式细胞仪受伤/病理中枢神经系统的细胞炎症的定量分析是复杂的脂质/髓鞘碎片，可以有类似的大小和肉芽细胞，减少敏感性/准确性。我们拥有先进的一个细胞的制备方法去除髓鞘碎片和改善由流式细胞仪检测在脊髓损伤细胞检测。

摘要

免疫细胞在受伤的中枢神经系统（CNS）的使用形态或组织学技术检测并不总是提供真正的细胞炎症的定量分析。流式细胞仪是一种快速的替代方法来量化免疫细胞在脑损伤或脊髓组织。从历史上看，流式细胞仪已用于量化收集到的免疫细胞从血液中分离脾脏或胸腺，只有少数的研究试图量化流流式细胞仪使用新鲜分离的脊髓组织的免疫细胞在脊髓损伤。然而，分离脊髓组织集中髓鞘碎片可以被误认为是细胞，减少细胞计数流式细胞仪获得的可靠性。我们拥有先进的一个细胞的制备方法，使用OptiPrep梯度系统有效地分离脂质/髓鞘碎片从细胞，流式细胞仪在受伤脊髓细胞炎症反应灵敏，可靠的量化。正如我们在最近的一项研究（ 贝克＆阮等，脑2010年2月，133（PT 2）：。433-47），OptiPrep细胞制备增加了灵敏度，检测细胞在脊髓损伤炎症，与计数特定类型的细胞损伤的严重程度相关。更重要的是，这种方法的新颖使用提供的急性和慢性脊髓损伤后的细胞炎症的第一个表征，包括完成时间为多形核白细胞的过程（中性粒细胞，中性粒细胞），巨噬细胞/小胶质细胞，近一个时期的T细胞，从2小时伤后180天（DPI），确定一个令人惊讶的的小说细胞炎症的第二阶段。彻底表征细胞炎症，使用这种方法可能提供一个更好的neuroinflammation了解，在受伤的中枢神经系统和多相neuroinflammation揭示了一个重要的组成部分可能关键的设计和合理的治疗服务战略的实施，包括基于细胞和药理脊髓损伤的干预措施。

研究方案

1。解离脊髓组织

1. 脊髓节段T8 - T10无伤或挫伤脊髓受伤（伤在T9）SD大鼠进行解剖和机械与罚款剪刀在室温下的HBSS分离，如前面所述^1。组织分解之前，整个脊髓列前5分钟线细分T8 - T10提取存放在干冰。
2. 组织位被检索离心（1分钟的，为1000 rpm，室温）和酶2.5毫克胰蛋白酶和5毫克胶原酶5毫升二甲醚（贝科的修改鹰的媒体）20分钟，在37 °前trituration彗星（分离〜10倍在室温下）与巴斯德玻璃吸管（9英寸）。
3. 二甲醚+ 10％胎牛血清的10毫升加入到细胞，抑制酶的活动，然后通过一个40微米的细胞滤网过滤。快速旋转后，细胞沉淀悬浮于6毫升的HBSS OptiPrep梯度的解决方案如下所述重叠。

2。创建OptiPrep渐变的解决方案

1. 摊薄OptiPrep构造OptiPrep 1:1稀释MOPS缓冲液（0.15 M氯化钠（NaCl），10毫米拖把，pH值7.4）。
2. 混合350，250，200，或150μL稀释1毫升（见表1）的最终体积的HBSS OptiPrep作了四个OptiPrep梯度的解决方案。
3. 四种解决方案是缓慢而小心地放置在一个15毫升的锥形管与底部至少淡化，最顶部（图1A）稀释层。

3。从细胞中分离脂质/髓鞘碎片

1. 6毫升的HBSS分离的脊髓细胞进行了仔细的分层的OptiPrep梯度解决方案上。
2. 离心管中的细胞和梯度解决方案（15分钟，1900 rpm或726 RCF 20 ° C）使用的Eppendorf离心机5810R斗摆动转子（A - 4 - 62），分成不同的层与脂质的电池解决方案/髓鞘碎片（前7毫升管），3层的神经元，与炎症细胞，神经胶质细胞，和红细胞颗粒。虽然大部分的炎症细胞，包括单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞粒，和淋巴细胞沉淀中发现，一些大型激活的巨噬细胞可以发现，在沉淀层以上。
3. 脂质/髓鞘碎片层（前7毫升）进行了仔细的吸气和删除。细胞，然后洗净，悬浮于2.5毫升的HBSS，用于免疫标记下面。

4。特定的免疫细胞的免疫标记流式细胞仪

1. 颗粒细胞（500μL）收集脊髓准备5分钟，以溶解红细胞悬浮在0.85％的氯化铵（蒸馏水稀释）。
2. 500μL的HBSS洗涤细胞，然后挡在正常兔或小鼠血清在室温30分钟。
3. 洗涤细胞，并在室温下孵育1小时抗体（FITC标记的兔抗中性粒细胞，精确的化学和科学;小鼠抗大鼠ED1 Alexa的488 Serotec;或小鼠抗大鼠CD3 Alexa的488）或同型IgG溶液稀释的HBSS（1:100稀释），如前面描述的^1。
4. 洗涤细胞两次后的最后一步后每个重悬于300μL的HBSS上述步骤，然后。

5。通过流式细胞仪检测细胞的定量评估

1. 一个流式细胞仪刀魂（流式细胞Dickinson公司）使用Cell Quest软件的流式细胞仪样本进行了分析。读取所有的样品，每个样品5000事件和首脑会议（DakoCytomation）完成数据分析。
2. 流式细胞仪门设置使用控制IgG抗体亚型标记的细胞或从没有受伤的控制动物的脊髓细胞正常化跨越时间点为基准值^，前面描述1。积极标记细胞的平均值，表示为％（± SEM）的整个样本。

6。代表性的成果：

OptiPrep梯度清除髓鞘碎片和提高免疫细胞的流式细胞仪检测能力进行了评估量化脊髓中性粒细胞在1 DPI（图1B），中性粒细胞浸润以前^1-3脊髓损伤后的高峰期。另外，相同的解剖脊髓无髓鞘碎片OptiPrep清除酶分离，并通过流式细胞仪检测中性粒细胞渗透的同时，同样，在评估。正如我们以前报道^1，有OptiPrep梯度纯化方法相比，酶解单独隔离的样本中的事件的立场的转变，体现了完整的髓鞘碎片样本检测中性粒细胞的百分比只有一小部分（0.5％） OptiPrep purif检测中性粒细胞的百分比（5.1％）IED样品（图1B）。这些数据表明，在组织筹备工作的髓鞘碎片可以掩盖流式细胞仪的读数，并证明，髓鞘碎片的清除，增强了受伤的脊髓组织中的免疫细胞检测的灵敏度。

我们在建立OptiPrep梯度系统的细胞在脊髓损伤的检测灵敏度，超过期限从2小时到180 dpi的特点细胞浸润的变化，并建立一种新型的多相反应脊髓损伤后的炎症细胞，包括中性粒细胞，巨噬细胞/小胶质细胞和T细胞。 ^1-3以往的研究证实，中性粒细胞在伤后2小时首次进入线，并在1见顶DPI（图2和4） 。直到3 dpi的巨噬细胞/小胶质细胞， ^另一方面 1,4,5，没有发现在脊髓损伤，并在7 DPI（图3＆4）初步见顶。令人惊讶的是，我们显示，巨噬细胞/小胶质细胞的第二次60 DPI达到顶峰，并保持180 DPI（图3＆4）升高的第一次。巨噬细胞/小胶质细胞，类似的T -细胞浸润高峰预计7 DPI ^5-7;然而，流式细胞仪检测没有发现在第7 DPI在T细胞数量的任何变化，但检测到T细胞升高， 9 DPI（1.6％）（图4）。虽然T细胞的数量减少10 DPI，180 dpi的持久性T细胞的反应观察，当时4.4％的细胞被标记为CD3（图4）。

一起，这些数据表明一个SCI后的细胞炎症（图4）随时间变化的多相响应;细胞炎症的初期人的中性粒细胞1早高峰由DPI一个的ED1峰+巨噬细胞/小胶质细胞7 DPI和T其次细胞9 DPI，而在后期阶段，所有三种细胞与巨噬细胞/小胶质细胞的一个显着的第二个高峰期在60 dpi的人口上升后，14 DPI，并坚持通过180 dpi的，组成。这timecourse研究和流式细胞仪所产生的量化数据，先前已验证，从^{immunolabeled}脊髓第1定量体视收集到的数据显示类似的结果。

表1。 OptiPrep去除髓鞘碎片梯度准备。四个OptiPrep梯度的解决方案是使用的HBSS和稀释OptiPrep OptiPrep和拖把（1:1稀释）。

图1。OptiPrep梯度密度分开最受伤的脊髓组织/细胞的髓磷脂/碎片和提高免疫细胞的流式细胞仪评估。 （一）髓鞘/碎片分离后通过髓鞘/碎片层的愿望OptiPrep梯度离心分离脊髓组织细胞（神经元，神经胶质细胞和免疫细胞）。 （二）中性粒细胞在脊髓损伤，呈现在检测杂物清除后的中性粒细胞的敏感性增加（学生t检验，P = 0.0001）。所有流式细胞仪门，用未受伤的动物标记的细胞; N =每5组，平均± SEM 。每个样品5000事件被读取所有样品和积极标记细胞的平均值作为整个样本％（± SEM）的表达。

图2。中性粒细胞浸润流式细胞仪在受伤脊髓的检测。一个中度（200 KD）T9挫伤损伤后，中性粒细胞迅速开始（二）伤后2小时和调峰1 DPI（三）进入脊髓。所有流式细胞仪门是用未受伤的动物标记的细胞（A）。

图3的通过流式细胞仪在受伤脊髓的巨噬细胞/小胶质细胞浸润检测。一个适中（200 KD）在T9挫伤损伤后，ED1 +巨噬细胞/小胶质细胞数量增加损伤脊髓3 DPI（四）起，达到高峰在7 DPI（五）急性，在14 DPI（六）跌至较低水平前上升到60 DPI（G）的第二个高峰期，在脊髓损伤仍高达180 DPI（高）。 IgG抗体亚型7 DPI脊髓细胞的控制标签（二）表明最小的抗体标记的背景并没有从2小时抗体标记细胞受伤后（C）或没有受伤（一）动物的区别。所有流式细胞仪门是用未受伤的动物标记的细胞。

表2。 timecourse实验动物样本 ，每个时间点（0小时为180 dpi），五禽戏在T9，一个中度（200 KD）挫伤损伤，通过流式细胞仪检测中性粒细胞，ED1 ⁺巨噬细胞/小胶质细胞^{和CD3 +} T细胞的数量进行了评估和脊髓组织。然而，并非所有的动物样本被成功恢复为中性粒细胞（4-5），ED1（3-5）和CD3（4-5）流式细胞仪分析。

图4。timecourse以下温和（200 KD）T9挫伤损伤脊髓细胞炎症。见顶敏锐地评估流式细胞仪，中性粒细胞的数量^，ED1 +巨噬细胞/小胶质细胞，和^{CD3 + T}细胞（1,7，和9 DPI，分别）和脊髓损伤的长期坚持。N = 3〜 5％组，平均± SEM。

讨论

流式细胞仪的量化免疫细胞在中枢神经系统的使用是复杂的脂质/髓磷脂含量和碎片。除了 ​​与抗体结合的特异性干扰，髓鞘碎片可以有类似的免疫细胞的大小和肉芽属性，减少测量的灵敏度^和准确性8。这里描述的新的细胞制备方法是有效去除髓鞘碎片，从而提高了检测脊髓损伤的细胞炎症的变化，流式细胞仪的灵敏度。举例来说，通过这种方法增强免疫细胞的检测的髓鞘碎片去除酶解alone.Critically相比，使用这种方法的新颖允许急性和慢性蜂窝炎症的第一表征脊髓损伤后，包括一个完整的中性粒细胞日久，巨噬细胞/小胶质细胞，T细胞为180 dpi，并确定了一个新颖的第二阶段，细胞炎症。这些重要的发现的一个neuroinflammation多相组成部分，可能是关键的设计和实施合理的治疗的治疗策略，包括脊髓损伤的细胞为基础的药物干预。

OptiPrep梯度系统已经使用单独的碎片从⁹血液中的细胞，或从脑细胞培养^的目的10净化神经元;不过，我们已修改和先进的这种方法系统，单独从脊髓分离的细胞髓鞘碎片，并允许快速，更准确的定量流式细胞仪检测细胞炎症。可能这种方法用流式细胞仪，以提供在炎症研究中的重大进步后中枢神经系统受伤或病理条件下，作为大多数的研究都只能特征的形态组织学技术，是不是单元式专用或能不能始终提供真正的中枢神经系统的细胞炎症量化考核。此外，最近的一些研究已经试图量化流流式细胞仪使用新鲜分离的脊髓组织^11,12或¹³ Percoll梯度系统分离细胞的免疫细胞在脊髓损伤，然而，这些研究证明或低细胞产生，或不敏感免疫细胞的检测。

相比之下，首次提供OptiPrep梯度细胞的制备方法，灵敏，可靠，流式细胞仪定量评估损伤的严重程度分级，并在延长timecourse高达180 dpi的细胞炎症的变化。流式细胞仪分析的灵敏度和可靠性，还取决于用于检测特定的免疫细胞类型的特异性抗体，流式细胞仪不允许形态标准，以进一步区分的细胞类型。中性粒细胞，巨噬细胞/小胶质细胞或T -告诉的特异性抗体已经彻底流式细胞仪进行测试，文化和细胞腹腔中性粒细胞和肺泡巨噬^细胞在脊髓损伤组织1,2。连同OptiPrep梯度系统，用于流式细胞仪检测这些抗体作出贡献的一代进入SCI的微环境的动态提供了新的见解，并首次确定一个扩展的多相反应的细胞炎症反应的时间和定量分析细胞炎症。这种细胞在脊髓损伤后的多相反应可能是重要的调查目前在伤后的特定时间，特定的细胞类型的角色，或对特定的细胞类型，可加重受伤产生的治疗性干预。此外，这些研究结果可能有助于在一个适当的理由发展，为脊髓损伤的最佳药物或细胞为基础的的干预。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号
OptiPrep	Fisher Scientific则	NC9182490
的HBSS	西格玛	H1387
兔抗大鼠中性粒细胞（FITC）	精确的化学与科学	AIFAD51140
小鼠抗大鼠ED1（的Alexa Fluor 488）	ABD Serotec	MCA341A488
小鼠抗大鼠CD3（FITC）	ABD Serotec	MCA772F
胰蛋白酶	西格玛	T9935
胶原酶	西格玛	C5138
二甲醚	西格玛	D1152
鼠IgG1（的Alexa Fluor 488）	ABD Serotec	MCA1209A488
胎牛血清	Hyclone公司	SH30070.03
兔血清	杰克逊ImmunoResearch	011-000-120011-000-120
小鼠血清	杰克逊ImmunoResearch	015-000-120
细胞过滤器	屋宇署猎鹰	352340