Évaluation quantitative des cellules immunitaires dans le tissu blessés médullaires par cytométrie en flux: une nouvelle utilisation pour un procédé de purification cellulaire

Résumé

Quantification de l'inflammation cellulaire dans le SNC blessé / pathologiques par cytométrie en flux est compliquée par des lipides / myéline des débris qui peuvent avoir la même taille et la granulation des cellules, diminution de la sensibilité / précision. Nous avons avancé une méthode de préparation des cellules pour enlever les débris de myéline et améliorer la détection de cellules par cytométrie en flux dans la moelle épinière lésée.

Résumé

Détection de cellules immunitaires dans le système de blessés nerveux central (SNC) en utilisant des techniques morphologiques ou histologiques n'a pas toujours fourni vraie analyse quantitative du inflammation cellulaire. La cytométrie en flux est une méthode rapide alternative à quantifier les cellules immunitaires dans le cerveau lésé ou de tissus de la moelle épinière. Historiquement, la cytométrie de flux a été utilisée pour quantifier les cellules immunitaires du sang collecté ou de la rate ou du thymus dissocié, et seules quelques études ont tenté de quantifier les cellules immunitaires dans la moelle épinière lésée par cytométrie en flux utilisant fraîche moelle dissociée. Cependant, les tissus de la moelle épinière dissociée est concentré avec des débris de myéline qui peut être confondu avec les cellules et réduisent la fiabilité nombre de cellules obtenues par le cytomètre en flux. Nous avons avancé une méthode de préparation de cellules en utilisant le système de gradient OptiPrep pour séparer efficacement les lipides / myéline débris de cellules, fournissant quantifications sensible et fiable de l'inflammation cellulaire dans la moelle épinière lésée par cytométrie en flux. Comme décrit dans notre étude récente (Beck & Nguyen et al, Brain 2010 Feb; 133 (Pt 2):.. 433-47), la préparation de cellules OptiPrep avait augmenté la sensibilité pour détecter l'inflammation cellulaire dans la moelle épinière lésée, avec un nombre de types de cellules spécifiques en corrélation avec la gravité des blessures. Critique, l'utilisation originale de cette méthode fourni la première caractérisation de l'inflammation cellulaire aiguë et chronique après la SCI afin d'inclure un cours à temps complet pour les leucocytes polynucléaires (PMN, neutrophiles), les macrophages / microglie et les cellules T sur une période allant de 2 heures pour 180 jours après la blessure (ppp), l'identification d'une phase nouvelle surprenante deuxième inflammation cellulaire. La caractérisation approfondie de l'inflammation cellulaire en utilisant cette méthode peut fournir une meilleure compréhension de la neuroinflammation dans le SNC blessés, et de révéler un élément important de la neuroinflammation multiphasiques qui peuvent être critiques pour la conception et la mise en œuvre des stratégies rationnelles de traitement thérapeutique, y compris les cellulaires et pharmacologiques interventions pour SCI.

Protocole

1. La dissociation de la moelle épinière

1. Segments de la moelle épinière T8-T10 de non-blessés ou de la moelle épinière blessée contusions (blessures à T9) des rats Sprague-Dawley ont été disséqués et dissociées mécaniquement avec des ciseaux fins dans HBSS à température ambiante, comme décrit précédemment ^1. Avant de tissus de dissociation, l'ensemble des colonnes de la moelle épinière ont été conservés sur la glace sèche pendant 5 minutes avant l'extraction des segments de la moelle T8-T10.
2. Morceaux de tissus ont été récupérées par centrifugation (1 minute, 1000 rpm, température ambiante) et enzymatiquement dissocié avec 2,5 mg de trypsine et 5 collagénase mg dans 5 ml de DME (Media Eagle modifié par Dulbecco) pour 20 minutes à 37 ° C avant la trituration (~ 10 fois à température ambiante) avec une pipette Pasteur en verre (9 pouces).
3. 10 ml de DME de sérum + 10% de veau fœtal a été ajouté aux cellules d'inhiber les activités enzymatiques et puis a été filtré à travers un tamis cellule 40 um. Après un tour rapide, le culot cellulaire a été resuspendu dans 6 ml de HBSS et superposés sur des solutions gradient OptiPrep décrit ci-dessous.

2. Créer des solutions OptiPrep gradient

1. OptiPrep dilué a été construit en diluant OptiPrep 01h01 avec le tampon MOPS (0,15 M de NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4).
2. Quatre solutions OptiPrep gradient ont été faites en mélangeant 350, 250, 200 ou 150 OptiPrep ul dilué avec de l'HBSS à un volume final de 1 ml (tableau 1).
3. Les quatre solutions ont été lentement et soigneusement placés par couches dans un tube de 15 ml conique avec le moins diluées dans le bas et le plus dilué sur le haut (figure 1A).

3. Séparation des lipides / myéline débris de cellules

1. 6 ml de cellules dissociées épinière dans HBSS a été soigneusement superposées à des solutions gradient OptiPrep.
2. Tube contenant des cellules et des solutions de gradient a été centrifugé (15 minutes, 1900 tours par minute ou 726 RCF, 20 ° C) en utilisant une centrifugeuse Eppendorf 5810R avec un rotor libre seau (A-4-62), qui sépare la solution de cellules en couches distinctes avec des lipides / débris de myéline (en haut du tube de 7 ml), suivie par trois couches de neurones, des cellules inflammatoires, cellules gliales, et les globules rouges dans le culot. Bien que la plupart des cellules inflammatoires, y compris les monocytes, les macrophages, les granulocytes neutrophiles et les lymphocytes ont été retrouvés dans le culot, certains de grande taille macrophages activés pourrait être trouvée dans des couches-dessus du culot.
3. La couche de débris de lipides / myéline (en haut de 7 ml) a été soigneusement aspirés et enlevé. Les cellules ont ensuite été lavées et resuspendues dans 2,5 ml de HBSS et utilisé pour immunomarquage ci-dessous.

4. L'immunomarquage de cellules immunitaires spécifiques pour la cytométrie en flux

1. Cellules (500 pi) collectées à partir des préparations de la moelle épinière ont été sédimentées et resuspendues dans du chlorure d'ammonium 0,85% (dilué dans de l'eau distillée) pendant 5 minutes pour lyser les globules rouges.
2. Les cellules ont été lavées avec 500 ul de HBSS puis bloquée pendant 30 minutes dans de lapin normal ou de sérum de souris à la température ambiante.
3. Les cellules ont été lavées et incubées à température ambiante pendant 1 heure avec l'anticorps (lapin anti-PMN FITC, chimique exacte et scientifique; Souris anti-rat ED1 Alexa 488, Serotec; ou à la souris anti-rat CD3 Alexa 488) ou isotype IgG solution diluée dans HBSS (tous à dilution 1:100), comme décrit précédemment ^1.
4. Les cellules ont été lavées deux fois après chaque étape ci-dessus et ensuite remis en suspension dans 300 ul de HBSS après l'étape finale.

5. L'évaluation quantitative de cellules par cytométrie en flux

1. Les échantillons ont été analysés sur un cytomètre de flux FACS Calibur (Becton-Dickinson) en utilisant le logiciel Cell Quest. 5000 événements par échantillon ont été lus pour tous les échantillons et l'analyse des données a été achevée avec Summit (DakoCytomation).
2. Portes par cytométrie en flux ont été mis en utilisant le contrôle de cellules IgG isotype étiquetés ou des cellules de la moelle épinière des animaux de contrôle indemne de définir les valeurs de base pour la normalisation à travers des points de temps, comme décrit précédemment ^1. Les valeurs moyennes de cellules positivement marquées ont été exprimées en pour cent (± SEM) de l'ensemble de l'échantillon.

6. Les résultats représentatifs:

La capacité d'un gradient OptiPrep pour enlever les débris de myéline et améliorer la détection de cellules immunitaires par cytométrie en flux a été évaluée par la quantification PMN épinière à 1 dpi (figure 1B), le pic indiqué précédemment d'infiltration des PMN, après la SCI ^1-3. Sinon, à l'identique de la moelle épinière ont été disséqués enzymatiquement dissocié sans OptiPrep-enlèvement des débris de la myéline et étaient aussi évalués en parallèle pour l'infiltration des PMN par cytométrie en flux. Comme nous l'avons indiqué précédemment ^1, il y avait un changement dans la position des événements dans des échantillons isolés avec la méthode de purification OptiPrep gradient par rapport à la dissociation enzymatique seul, démontrant le pourcentage des PMN détectée dans les échantillons avec des débris de myéline intacte était seulement une fraction (0,5%) le pourcentage des PMN détectés (5,1%) dans OptiPrep Puriféchantillons étudiés (figure 1B). Ces données suggèrent que les débris de myéline dans des préparations de tissus peut masquer lectures de cytométrie en flux, et démontrer que l'enlèvement des débris de myéline accroît la sensibilité de détection des cellules immunitaires dans les tissus de la moelle épinière.

Ayant établi la sensibilité du système de gradient pour la détection OptiPrep cellule dans la moelle épinière lésée, nous avons caractérisé les changements dans l'infiltration cellulaire sur une période allant de 2 heures à 180 dpi et a établi une nouvelle réponse multiphasique de l'inflammation cellulaire après la SCI qui comprenait les PMN, les macrophages / microglie et des T-cellules. Comme confirmé par des études antérieures ^1-3, PMN est entré dans le cordon à 2 heures après la blessure et a culminé à 1 dpi (figure 2 & 4). Les macrophages / cellules microgliales, d'autre part ^1,4,5, n'ont pas été détectés dans la moelle épinière lésée jusqu'à 3 dpi, et culminé initialement à 7 dpi (figure 3 & 4). Étonnamment, nous montrons pour la première fois que les macrophages / cellules microgliales a culminé pour la deuxième période de 60 dpi et est restée élevée à 180 dpi (figure 3 & 4). Similaires aux macrophages / microglies, les cellules T d'infiltration a été prédit à pic 5 au ⁷ juillet dpi, cependant, la cytométrie de flux n'a pas de détecter tout changement dans les cellules T dans le numéro de 7 premiers dpi, même si un nombre élevé de cellules T a été détectée à 9 dpi (1,6%) (figure 4). Alors que les cellules T nombre était en baisse de 10 dpi, une persistante réponse des lymphocytes T a été observée à 180 dpi, date à laquelle 4,4% des cellules ont été marquées pour CD3 (figure 4).

Ensemble, ces données démontrent une réponse dépendant du temps multiphasique d'inflammation cellulaire après un traumatisme médullaire (figure 4); les phases initiales de l'inflammation cellulaire étaient composés du pic précoce de PMN 1 ppp suivie d'un pic de ED1 + macrophages / cellules microgliales 7 dpi et T 9-cellules ppp, tandis que les phases ultérieures étaient composés de trois populations cellulaires hausse après 14 dpi et persistant à travers 180 ppp, avec un pic notable seconde des macrophages / cellules microgliales à 60 dpi. Cette étude timecourse et les données quantitatives générées par cytométrie en flux ont été validées précédemment, montrant des résultats comparables aux données recueillies auprès stéréologie quantitative de immunomarquées sections de la moelle épinière ^1.

Tableau 1. Préparation du gradient OptiPrep pour l'enlèvement des débris de myéline. Quatre solutions gradient OptiPrep sont faites en utilisant HBSS et dilué OptiPrep (1:1 dilution de OptiPrep et MOP).

Figure 1. Densités gradient OptiPrep plupart séparés myéline / débris de blessés médullaires des tissus / cellules et d'améliorer l'évaluation des cellules immunitaires par cytométrie en flux. (A) la myéline / débris ont été séparés de cellules (neurones, cellules gliales et les cellules immunitaires) après centrifugation de la moelle épinière dissociée par un gradient OptiPrep suivie par l'aspiration de la myéline / débris couche. (B) le nombre de PMN dans la moelle épinière lésée, montrant une sensibilité accrue dans la détection des PMN, après l'enlèvement des débris (t de Student-test, p = 0,0001). Toutes les portes ont été mis en cytométrie en flux utilisant des cellules étiquetées à partir d'animaux indemnes, n = 5 par groupe, moyenne ± SEM. 5000 événements par échantillon ont été lus pour tous les échantillons et les valeurs moyennes des cellules positivement marquées ont été exprimées en pour cent (± SEM) de l'ensemble de l'échantillon.

Figure 2. Détection de l'infiltration des PMN dans la moelle épinière lésée par cytométrie en flux. Après une blessure contusion (200 kd) modérée à T9, PMN est rapidement entré la moelle épinière à partir de 2 heures (B) post-traumatique et de pointe 1 ppp (C). Toutes les portes ont été mis en cytométrie en flux utilisant des cellules étiquetées à partir d'animaux indemnes (A).

Figure 3. Détection des macrophages / infiltration microglie dans la moelle épinière lésée par cytométrie en flux. Après une blessure contusion (200 kd) modérée à T9, ED1 + macrophages / microgliales nombre accru de la moelle épinière lésée à partir de 3 ppp (D), a atteint un sommet aigu à 7 dpi (E), a chuté à des niveaux bas à 14 dpi (F) , avant de remonter à un second pic à 60 dpi (G), et est resté dans la moelle épinière lésée jusqu'à 180 dpi (H). Étiquetage IgG contrôle isotypique de 7 dpi cellules épinière (B) ont montré peu d'anticorps-étiquetage et aucune différence de fond aux cellules d'anticorps marqués à partir de 2 heures l'après-blessés (C) ou indemnes (A) des animaux. Toutes les portes ont été mis en cytométrie en flux utilisant des cellules étiquetées à partir d'animaux sains et saufs.

Tableau 2. Échantillons d'animaux dans des expériences timecourse. Pour chaque point de temps (0 h à 180 ppp), cinq animaux ont reçu une blessure contusion modérée (200 kD) au T9,et les tissus de la moelle épinière ont été évalués par cytométrie en flux pour le nombre de PMN, les macrophages ED1 ⁺ / microglie, et CD3 ⁺ T-cellules. Cependant, tous les échantillons d'animaux ont été récupérés avec succès pour PMN (4-5), ED1 (3-5) et CD3 (4-5) des analyses du flux cytométrique.

Figure 4. Un timecourse d'inflammation cellulaire dans la moelle épinière suite à une blessure contusion (200 kd) modérée à T9. Comme évalué par cytométrie en flux, le nombre de PMN, les macrophages ED1 ⁺ / microglie, et CD3 ⁺ T-cellules culminé aiguë (1,7, et 9 dpi, respectivement) et ont persisté dans la chronique de la moelle épinière lésée. N = 3 à 5 pour groupe, moyenne ± SEM.

Discussion

L'utilisation de la cytométrie en flux pour quantifier les cellules immunitaires dans le SNC est compliquée par des lipides / myéline contenu et de débris. En plus d'interférer avec la liaison d'anticorps et la spécificité, les débris de myéline peut avoir des dimensions et des propriétés similaires aux cellules immunitaires de granulation, en diminuant la sensibilité et la précision de mesure ^8. La méthode de préparation de nouvelles cellules décrit ici est efficace pour éliminer les débris de myéline et améliore ainsi la sensibilité de la cytométrie en flux pour détecter des changements dans l'inflammation cellulaire dans la moelle épinière lésée. Par exemple, l'enlèvement des débris de myéline par cette méthode de détection améliorée des cellules immunitaires par rapport à la dissociation enzymatique alone.Critically, l'utilisation originale de cette méthode a permis la première caractérisation de l'inflammation cellulaire aiguë et chronique après la SCI afin d'inclure un cours à temps complet pour les PMN, macrophages / microglies, les cellules T et jusqu'à 180 dpi, et identifié une phase deuxième roman de l'inflammation cellulaire. Ces résultats importants d'une composante de la neuroinflammation multiphasiques peut être critique pour la conception et la mise en œuvre des stratégies rationnelles de traitement thérapeutique, y compris les interventions à la fois cellulaires et pharmacologiques de la SCI.

Le système de gradient OptiPrep a été utilisée pour séparer les débris des cellules dans le sang ^neuf, ou neurones du cerveau purifier à des fins de culture de cellules ^10, mais nous avons modifié et avancé ce système méthode pour séparer les débris de myéline par les cellules de la moelle épinière dissociées, et a permis quantification rapide et plus précise de l'inflammation cellulaire par cytométrie en flux. Cette méthode en collaboration avec la cytométrie de flux est susceptible de fournir avancée significative dans la recherche inflammation après lésions du SNC ou de conditions pathologiques, comme la plupart des études ont seulement caractérisé inflammation cellulaire dans le SNC en utilisant des techniques morphologiques et histologiques qui ne sont pas un type de cellule spécifique ou ne peuvent pas toujours fournir des informations vraies évaluation quantitative. Par ailleurs, quelques études récentes ont tenté de quantifier les cellules immunitaires dans la moelle épinière lésée par cytométrie en flux utilisant fraîche moelle ou de cellules dissociées ^11,12 séparés par le système de gradient de Percoll ^13; cependant, ces études ont démontré soit rendements cellulaires faibles ou insensibles détection des cellules immunitaires.

En revanche, le gradient OptiPrep cellules méthode de préparation a fourni pour la première fois, sensible et fiable d'évaluation quantitative par cytométrie en flux à l'évolution de l'inflammation cellulaire en réponse à la gravité des blessures classées et sur une timecourse prolongée jusqu'à 180 dpi. La sensibilité et la fiabilité de l'analyse par cytométrie en flux dépendra aussi de la spécificité des anticorps utilisés pour détecter les types de cellules immunitaires spécifiques, comme la cytométrie de flux ne permet pas de critères morphologiques pour mieux distinguer les types de cellules. La spécificité des anticorps pour les PMN, les macrophages / cellules microgliales ou T-dit a été testé à fond en cytométrie en flux pour les PMN péritonéale et les macrophages alvéolaires dans la culture et les cellules de la moelle épinière blessée ^1,2 tissus. Avec le système de gradient OptiPrep, ces anticorps utilisés pour la cytométrie de flux ont contribué à la génération d'une analyse temporelle et quantitative de l'inflammation cellulaire qui a fourni une nouvelle perspective sur la dynamique du microenvironnement SCI, et identifié pour la première fois une réponse étendue multiphasiques de l'inflammation cellulaire. Cette réponse multiphasique des cellules après la SCI peut être important d'étudier le rôle des types cellulaires spécifiques présents à des moments précis après une blessure ou de générer des interventions thérapeutiques contre certains types spécifiques de cellules qui peuvent aggraver les blessures. En outre, ces résultats peuvent aider à l'élaboration d'une justification appropriée pour les interventions de drogue ou d'une cellule à base optimale pour la SCI.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue
OptiPrep	Fisher Scientific	NC9182490
HBSS	Sigma	H1387
Lapin anti-rat PMN (FITC)	Chimique précis et scientifique	AIFAD51140
Souris anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488)	AbD Serotec	MCA341A488
Souris anti-rat CD3 (FITC)	AbD Serotec	MCA772F
Trypsine	Sigma	T9935
Collagénase	Sigma	C5138
DME	Sigma	D1152
SOURIS IgG1 (Alexa Fluor 488)	AbD Serotec	MCA1209A488
Sérum fœtal bovin	Hyclone	SH30070.03
Sérum de lapin	Jackson ImmunoResearch	011-000-120011-000-120
Sérum de souris	Jackson ImmunoResearch	015-000-120
Passoire cellulaire	BD Falcon	352340