大脑中动脉闭塞的小鼠模型

摘要

在视频中，我们证明了生产中使用腔内单丝的成年小鼠的大脑中动脉闭塞的方法。我们还展示了如何评价脑梗死的严重程度，由2,3,5 - 三苯基氯化四氮唑（TTC）染色。

摘要

中风是最常见的致命的神经系统疾病在^美国的1 。大多数的中风导致脑血管堵塞（缺血性中风^{）2（88％）。}由于在大脑中动脉^（MCA）3境内发生的最缺血性中风（〜80％），已开发的许多动物中风 ​​车型都集中在此动脉。腔内单丝大脑中动脉闭塞（MCAO）模型涉及到颈外动脉手术长丝插入线程到颈内动脉（ICA），直到提示阻塞的MCA的起源，在停止血流量和随后的脑梗死MCA ^领土 4 。该技术可用于模型永久或暂时闭塞⁵的。如果删除后一定的时间间隔（30分钟，1小时或2小时）缝合，是实现再灌注（瞬态缺血）;如果灯丝是留在原地（24小时）的程序是适合作为一个永久性缺血模型。这种技术并不需要去骨瓣，神经外科手术过程来删除一个头骨的一部分，这可能会影响颅内压和^温度 6 。它已成为最常用的方法来模仿永久性和短暂局灶性脑缺血大鼠和小鼠^7,8。为了评估脑梗死的严重程度，我们与2,3,5 -三苯基氯化四氮唑（TTC）染色脑切片，以确定脑^组织缺血9。在这段视频中，我们表现出缺血的方法和TTC染色测定梗死面积。

研究方案

1。缺血方法

该协议被批准机构动物护理和使用委员会，加州大学旧金山分校和美国肯特州立大学，并遵守国家机构使用实验动物的健康指引。

1. 切成20毫米段5-0单丝缝合（哈佛器械，Holliston，MA）。回合每个细分市场的一角，暖气附近cauterizer（布伦特里科学公司，布伦特里，马）。测量的提示使用千分尺（应用图像公司，罗彻斯特，纽约州）的直径。我们使用缝合最后的技巧鼠标与0.21-0.22毫米直径机身重量为25-30克。
2. 所有的手术工具消毒高压灭菌（最低121℃，15 Psi范围，为15分钟，）。使用70％乙醇消毒手术表及相关设备。
3. 麻醉一个8-12周龄小鼠（25-30克）用5％的异氟醚（Aerrane，巴克斯特，迪尔菲尔德，IL）70％，30％O ₂ / N _{2 O}的（VetEquip，公司使用的V - 10麻醉系统，普莱森顿，CA）。麻醉诱导后，降低异氟醚的水平，并维持在1.5％。
4. 鼠标放置在加热垫的仰卧姿势。插入直肠探头，监控并保持身体温度之间36.5-37.5℃使用的TR - 200 homeothermic温度系统（精细的科学工具公司，福斯特市，CA）。
5. 剃除电动快船（布伦特里科学）的皮肤暴露的腹侧颈部的皮毛。使用三个应用70％乙醇消毒手术部位。
6. 在一个立体解剖显微镜（日本尼康公司，），1厘米长的颈部正中切口。使用拉钩（布伦特里科学）暴露手术野，并确定右侧颈总动脉（CCA），颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。仔细解剖动脉周围神经及筋膜。
7. 进一步远端解剖非洲经委会和凝聚非洲经委会和甲状腺上动脉（STA）的分支，使用双极电凝（霍华德仪器公司，塔斯卡卢萨，铝）。在凝结段切非洲经委会和STA。
8. 松散地挂在非洲经委会残端两个8-0丝缝合。应用到非洲经委会和ICA的CCA分叉血管钳（精细科学的工具）。
9. 设为Vannas式弹簧剪刀（精细科学的工具），在非洲经委会残端年底的一个小切口。尖圆5-0单丝缝合的长度测量和记录。插入切口缝合，并提前钳。收紧两个丝线缝合管腔刚好够安全还保留在住宅单丝缝合的流动性。
10. 取出钳从分叉。轻轻提前进入ICA单丝缝合了9-10毫米以外的CCA分叉处闭塞马华起源的距离，从非洲经委会流明。手术时间约30-45分钟。
11. 缝合颈部切口和鼠标放置在一个35℃护理框从麻醉中恢复，并返回它的笼子。通常需要5-10分钟的小鼠从麻醉中恢复。要执行的瞬态缺血，研究人员可以重新麻醉鼠标，并撤回到非洲经委会残端缝合后一段时间，通常在0.5-2小时
12. 缺血诱导的二十四小时后，用5％的异氟醚麻醉的鼠标和安乐死颈椎脱位。杀头的鼠标和收集的大脑。 2毫米的大脑矩阵冰（布伦特里科学）分为四个片，脑冠状切片。孵育在2％的大脑切片2,3,5 - 三苯基氯化四氮唑（TTC）（Sigma - Aldrich公司）在1X PBS在室温为20分钟，以确定梗死的大小和程度。修复10％的脑切片中性缓冲福尔马林溶液（Sigma - Aldrich公司）在4 ° C，直到成像。在朱庇特协议955（ https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ^）9梗死的程度是可以量化的。

2。代表性的成果

在纹状体和背外侧皮层缺血产生的梗塞。纹状体是大脑皮层缺血更为敏感。在缺血30分钟会产生仅在纹状体梗塞，而超过一个小时的缺血损伤纹状体和皮层。永久性缺血24 h后，总梗塞百分比〜40 ±半球和手术后的死亡率5％〜10％。我们排除进一步研究老鼠如果在手术过程中发生出血过多，手术时间超过90分钟，小鼠从麻醉在15分钟内未能收回，或出血是在大脑切片或Willis环的基地在尸检发现。

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TTC染色脑切片图1。代表性的图像（冠状1-4级）永久性缺血24小时后。在活组织TTC酶减少脱氢酶1,3,5 triphenylformazan（TPF），这是红色的，而在坏死区，它仍然是白色的，由于缺乏这种酶的活性。因此，梗死面积，可以认定其白色由于缺乏转换的TTC TPF。注：TTC是有点热和光不稳定，以便从尽可能多的热和光保护染色切片。

讨论

在小鼠缺血是常用来模拟人类的脑缺血。中风研究小鼠的使用越来越频繁，由于转基因和基因敲除株的可用性。有几个重要的细节要注意在协议：

1. 重要的是在手术过程中保持体温鼠标，和之前完全从麻醉中复苏。体温已梗死的程度上的影响;低温跌幅和热疗增加梗死面积。
2. 在揭露和孤立CCA和非洲经委会的，避免破坏附近的迷走神经及气管，这可能会增加梗死面积，减少的可行性。
3. 切勿将超过10毫米的单丝缝合通过分叉。太远插入一个缝合穿孔导致脑出血，大脑前动脉。超出了分叉点约9-10毫米先进的缝合时，可以感觉到阻力。如果发生这种情况，研究人员应停止前进的缝合和确认距离。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Chemical	Baxter Internationl Inc.	95045-588
V-10 Anesthesia system	Equipment	VetEquip	901807
TR-200 Temp Controller	Equipment	Fine Science Tools	21060
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	CLP-9931
Dissecting microscope	Equipment	Nikon Instruments	SMZ745T
Retractor system	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	ACD-014
Bipolar coagulator	Equipment	Howard Instrument	64000
Silk suture	Material	Harvard Apparatus	510479
Monofilament suture	Material	Harvard Apparatus	723351
Vascular clamp	Equipment	Fine Science Tools	00396-01
Vannas scissor	Equipment	Fine Science Tools	15000-08
Brain matrix	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	BS-2000C
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma-Aldrich	T8877
10% neutral buffer formalin	Chemical	Sigma-Aldrich	HT5011