免疫组化：石蜡切片从Vector实验室使用Vectastain ABC试剂盒

摘要

摘要

免疫组织化学（IHC）是一个有价值的技术，利用本地化/可视化在安装组织部分使用特异性抗体蛋白表达。有两种方法：直接和间接的方法。在这个实验中，我们只描述使用间接免疫组化染色。间接免疫组化染色采用高度特异性的小学和中学生物素标记的抗体。主要是利用抗体绑定到特定的抗原表位，谨慎识别感兴趣的蛋白质，而二级抗体减去非特异性背景染色和放大，形成抗体复合物的主信号。幻灯片可以生成从冰冻切片，或石蜡包埋切片装在载玻片上。在这个协议中，我们讨论准备石蜡包埋切片，脱蜡，酒精梯度水化，热诱导的抗原修复，并阻断内源性过氧化物酶的活性和非特异性结合位点。部分路段，然后与CD8 + T细胞标记的特定抗体染色，有的则是酪氨酸羟化酶染色。随后与适当的结合，以生物素的抗体治疗的幻灯片，然后开发利用与Diaminiobenzidine（“民建联”）为底物的抗生物素蛋白结合的辣根过氧化物酶（HRP）。发展，幻灯片counterstained的对比，并根据与permount盖玻片上。充分干燥后，这些幻灯片，然后成像。

研究方案

石蜡切片的染色

1. 脱蜡二甲苯（费舍尔X3的^小号 -4），每次5分钟3倍幻灯片每个月使用情况（变化二甲苯，二甲苯是有毒的） 。费舍尔文献08 - 812 - 1A和机架的20张幻灯片中使用的菜肴和涵盖，以适应这些菜。菜每200毫升液体。
2. 水合物通过酒精梯度如下（变化梯度，每2周）：
   • 100％的乙醇（费舍尔＃A406 - 20）的2倍，每次2分钟
   • 在95％的乙醇2倍，每次2分钟
   • 1X在70％乙醇为2分钟
   • 1X在50％乙醇2分钟
   • 1X在30％乙醇2分钟
   • 1X DDH ₂ O为2分钟
3. 在DPBS浸泡5分钟（DPBS =贝科的修改后的磷酸盐缓冲生理盐水^{与Ca 2 +}和^{Mg 2} + ）。

抗原恢复：

1. 预热柠檬酸钠缓冲液（10毫米，pH值6.5）中的微波。
2. 库克在微波15分钟的幻灯片。幻灯片应永不干涸，所以检查每分钟，并添加柠檬酸钠必要时。
3. 在室温放凉。
4. 座内源性过氧化物酶的活性，用1％H _{2 O} 2（1.5毫升30％的股票在20分钟DPBS适马50毫升DPBS的H - 1009） 。
5. 浸泡在DPBS 3 × 5分钟。
6. 座在4 ° C的DPBS + 5％的牛血清白蛋白（BSA）的0.1％钠叠氮化物+ 5％血清过夜孵育的非特定网站。
   
   注：血清抗体染色品种的选择将取决于。块的二次抗体（共轭生物素）是物种的血清。如果这是不可用，使用从一个物种的不同，是其中主要AB的血清。
   
   
7. 座生物素与亲和素/生物素阻断试剂盒（矢量实验室目录＃SP - 2001）网站：
   • 与亲和素ð孵育15分钟。 DPBS冲洗简要。
   • 孵育15分钟的生物素的解决方案。
8. 在小学AB孵育2小时，在室温下，在DPBS + 2％BSA + NaAzide 0.1％+ 2％血清（作为阻塞步骤相同）。
9. 浸泡在PBS 3 × 5分钟。
10. 孵育二级AB为1小时，用生物素共轭室温在DPBS + 2％BSA + 0.1％叠氮钠+ 2％血清（阻塞步骤一样使用）。
11. 同时准备在ABC试剂，因为它已经开发使用前至少30分钟！ （见材料）
12. 准备在50毫升的锥形管。在15毫升DPBS（无血清，无叠氮），添加试剂3滴，混合，并添加3滴试剂B和组合。避免挤压的瓶子，而等待的下降，形成自己的。 ABC试剂盒Vectastain PK - 6100从Vector实验室。
13. 浸泡在DPBS 3 × 5分钟。
14. 与ABC试剂孵育在室温为30-45分钟。
15. 浸泡在DPBS 3 × 5分钟。
16. 民建联过氧化物酶底物（矢量实验室＃SK - 4100）准备于5 ml DDH _{2 O} 使用前在一个玻璃小瓶（见材料）
    • 缓冲库存溶液2滴，混合
    • 民建联4滴，混合（应成为淡棕色）
    • 2滴H ₂ O _2的混合
17. 拖放幻灯片上的民建联基板和观察为棕黄色染色。
18. 成冰浸幻灯片+自来水停止反应。
19. 冷的自来水下冲洗5分钟。
20. 苏木素复染液（20秒，费舍尔CS401 - D）和自来水冲洗，直到水出来。
21. 通过酒精梯度高达100％的乙醇（2分钟）在30％乙醇脱水。
22. 浸泡在二甲苯3 × 5分钟。
23. 山与Permount（费舍尔＃SP15 - 100）：把上述一些幻灯片上的部分慢慢地按到盖玻片部分无气泡。不要移动，直到完全干燥的盖玻片，约需24小时。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS			Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide			NaAzide
avidin/biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2001
Ab buffer			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	counterstain
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Slides and cover-slips			glass