İmmünohistokimya: Parafin Bölüm Vektör Labs Vectastain ABC Seti

Özet

Özet

Immünhistokimyasal (İHK) lokalize / spesifik antikorların bağlanmış bir doku bölümünde protein ekspresyonu görselleştirmek için kullanılan değerli bir tekniktir. Iki yöntem vardır: doğrudan ve dolaylı yöntem. Bu deneyde, biz sadece dolaylı İHK boyama anlatacağız. Dolaylı İHK boyama son derece özel, primer ve biyotin-konjuge sekonder antikorlar kullanır. İlköğretim antikorlar ikincil antikorlar, non-spesifik bir arka plan boyanması için çıkarma ve primer antikor kompleksleri oluşturarak sinyal yükseltmek discretely ilgi, belirli bir epitop bağlanarak proteinleri tespit etmek için kullanılmaktadır. Slaytlar ya frozen üretilen veya parafin bölümleri cam slaytlar üzerine monte edilmiş olabilir. Bu protokol, biz, alkol degrade kullanarak, endojen peroksidaz aktivitesini ve non-spesifik bağlayıcı siteleri dewaxing hidrasyon, ısıya bağlı antijen alma ve engelleme parafine gömülü bölümlerinin hazırlık tartışacağız. Daha sonra bazı bölümleri için özel antikorlar ile T hücre işaretleyici CD8 lekeli ve diğerleri tirozin hidroksilaz lekeli. Slaytlar sonradan biotin için konjuge uygun sekonder antikor ile tedavi edilir, sonra substrat olarak Diaminiobenzidine (DAB) avidin-konjuge horseradish peroksidaz (HRP) kullanılarak geliştirildi. Gelişimini izleyerek, slaytlar kontrast zıt, ve permount ile lamelleri altına monte edilmiştir. Yeterli kurutulduktan sonra, bu slaytları sonra görüntüleme için hazır.

Protokol

Kesitler boyanması

1. Mumunu gidermek, her 5 dakika için 3x Ksilen (Fisher ^X3 G -4) ile slayt (kullanıma bağlı olarak her ay değişikliği ksilen, ksilen ZEHİRLİ) . Fisher ref 08-812-1A ve raflar 20 slaytlar için yemekleri ve kapakları kullanın bu yemekler uygun yaptı. Başına 200 ml sıvı bulaşık.
2. (Her 2 haftada bir değiştirmek degrade) aşağıdaki gibi alkol degrade ile Hidrat:
   • % 100 etanol (Fisher # A406-20) her biri için 2 dakika içinde 2x
   • % 95 etanol içinde her biri 2 dakika 2x
   • 2 dakika süreyle% 70 etanol 1x
   • 1x 2 dakika süreyle% 50 etanol
   • 1x 2 dakika süreyle% 30 etanol
   • 1x 2 dakika süreyle GKD ₂ O
3. DPBS 5 dakika boyunca yıkayınız (DPBS = Dulbecco'nun modifiye Fosfat Ca ² Tamponlu Salin ⁺ ve Mg ^{2 +).}

Antijen kurtarma:

1. Mikrodalga ısı Öncesi Na-sitrat tamponu (10 mM, pH 6.5).
2. Slaytlar mikrodalga fırında 15 dakika pişirin. Slaytlar böylece her dakika kontrol etmek ve gerektiğinde Na-Sitrat eklemek kuru asla.
3. Oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
4. Endojen peroksidaz aktivitesini engellemek% 1 20 dakika DPBS H ₂ O ₂ (% 30 hisse senedinin 1,5 ml, 50 ml DPBS Sigma H-1009) .
5. DPBS 3 x 5 dakika bekletin.
6. +4 ° C DPBS +% 5 sığır serum albumini (BSA) +% 0.1 Na Azid +% 5 serum gece inkübe non-spesifik siteler engelleyin.
   
   Not: serum Choice boyanması için kullanılan antikorların yapıldığı türler bağlıdır. Ikincil Ab (biotin konjuge) yapıldığı türler serum ile engelleyin. Bu mevcut değilse, birincil Ab yapıldığı olandan farklı bir tür serum kullanın.
   
   
7. Avidin / biotin engelleme kiti (Vektör laboratuarlar katalog # SP-2001) ile biotin siteler Blok:
   • Avidin D 15 dakika inkübe edin. DPBS kısaca durulayın.
   • Biotin çözümü ile 15 dakika inkübe edin.
8. DPBS oda sıcaklığında 2 saat, BSA +% 2 +% 0.1 NaAzide +% 2 serum (adım Engelleme aynı) için birincil Ab inkübe edin.
9. PBS 3 x 5 dakika bekletin.
10. DPBS içinde oda sıcaklığı +% 2 BSA +% 0.1 Na Azid +% 2 serum (engelleme adım için kullanılan aynı). Az 1 saat biotin ile konjuge ikincil Ab ile inkübe
11. Kullanmadan önce en az 30 dakika süreyle geliştirmek zorundadır, çünkü aynı zamanda ABC reaktif hazırlayın! (Malzeme bakınız)
12. 50 ml konik bir tüp içinde hazırlayın. 15 ml DPBS (hiçbir serum, azid) reaktif 3 damla ekleyin, karıştırın ve 3 damla reaktif B ve karışımı ekleyin. Şişe sıkma kaçının yerine, kendi form damla bekleyin. Vektör Labs ABC kiti Vectastain PK-6100.
13. DPBS 3 x 5 dakika bekletin.
14. Oda sıcaklığında 30-45 dakika ABC reaktifi ile inkübe edin.
15. DPBS 3 x 5 dakika bekletin.
16. (Malzeme) kullanmadan önce hemen bir cam flakon, 5 ml _GKD 2 O (Vektör Labs # SK-4100) DAB peroksidaz substrat hazırlayın
    • 2 damla tampon stok solüsyonu, mix
    • DAB 4 damla, mix (hafif kahverengi haline gelmelidir)
    • 2 damla H ₂ O _2, mix
17. Bırak slaytların üstünde DAB yüzey ve kahverengi lekelere izlemek.
18. Buz içine batırın slaytlar + reaksiyonu durdurmak için su dokunun.
19. 5 dakika boyunca soğuk su altında durulayın.
20. Hematoksilen (20 sn; Fisher CS401-D) ile Counterstain ve su temizlemek gelene kadar musluk suyunda yıkayın.
21. Alkol degrade% 100 etanol (2 dk)% 30 etanol ile dehydrate.
22. Ksilen 3 x 5 dakika bekletin.
23. Permount Mount (Fisher # SP15-100): slaytta yukarıdaki bölüm koymak ve hava kabarcıkları olmadan bir bölümü ile lamel üzerine yavaşça basın. ~ 24 saat sürer, tamamen kuruyana kadar lamel hareket etmeyin.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS			Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide			NaAzide
avidin/biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2001
Ab buffer			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	counterstain
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Slides and cover-slips			glass