器官Ⅰ型胶原的含量可延展的平台，以评估细胞行为的一个3维的情况下

摘要

描述的方法，用于制备一个3 - 维的矩阵组成的I型胶原蛋白和初级人成纤维细胞。器官凝胶作为一个有用的基体，以评估侵入细胞的迁移，因为它模仿组织基质的基本功能，是适合各种形式的显微镜。

摘要

细胞迁移是生物学的许多方面，包括发育，伤口愈合，对免疫系统的细胞反应，肿瘤细胞转移的基础。迁移已研究盖玻片上，用光学显微镜，以使适合进行调查的细胞动力学。然而，现在已经很清楚，许多方面的细胞迁移取决于功能对本地环境，包括它的弹性，蛋白质的组合物，和孔径大小，没有忠实地表示的刚性的二维基板，如玻璃和塑料^1。此外，互动与其他类型的细胞，包括间质成纤维细胞和免疫细胞^3，已被证明发挥了关键作用，促进肿瘤细胞的侵袭。分子动力学，包括对药物治疗反应，相同的细胞时有显著差异相比，越来越显示出在分子水平上的调查在体内 ^4。

理想的情况下，这将是最好在其在生物体中的自然发生的上下文来研究细胞迁移，但是这并不总是可能的。中级组织培养系统，如细胞衍生的基质，基质胶，器官培养（这里描述的）组织外植体，类器官，以及异种移植物，因此，重要的实验中间体。这些系统近似的体内环境的某些方面，但更适合于实验操作，如使用稳定转染的细胞株，药物的治疗方案，长期和高分辨率成像。这种中间的系统是特别有用的试验场验证探头和建立所需的图像之前进行成像在体内 ⁵细胞和荧光记者的动态响应的参数。因此，它们可以起到重要的作用，在减少实验活着需要克动物。

研究方案

1。从皮肤外植体的成纤维细胞培养的建立

1. 4 mm打孔活检放置在从人力前臂获取的MEM培养基的100单位/ ml青霉素，100μg/ ml链霉素，0.25微克/毫升两性霉素B。
2. 修剪任何的皮下脂肪和切碎活检摇动一些24对陪替氏培养皿底部的手术刀刀片切成小块。
3. 将组织的淤浆中的25cm ²组织培养瓶中与初级成纤维细胞生长介质（MEM培养基与10％FCS，100单位/ ml青霉素，100μg/ ml链霉素，和25微克/毫升两性霉素B）补充，直到烧瓶中的表面覆盖，但液体的深度是不够的组织浮动。
4. 经过3天的培养，在37°C在5％CO ₂培养箱中，加入3毫升的主要成纤维细胞生长介质。
5. 另外3天的潜伏期变化的新鲜的成纤维细胞生长介质的媒体，或者CELLS是近汇合，他们可能会被分割到新鲜的培养基1:4。 （两性霉素B可以省略从这个点开始）。

2。第一阶段 - 从鼠尾I型胶原的制备

注：协议约12-14青少年（新鲜或冷冻）大鼠的尾巴

1. 准备大鼠尾通过在70％乙醇洗涤，并去除肌腱如下：
2. 删除从鼠尾皮肤切片，从顶部到底部，在中间的尾巴手术刀和敲打沿尾部的长度。
3. 分离从芯的近侧区的尾部肌腱。
4. 删除肌腱朝向远侧区的尾部避免鞘使用齿镊。
5. 通过在4℃下搅拌48小时提取肌腱的1克/ 250毫升的0.5M乙酸。
6. 提取物（7,500 xg离心）离心30分钟，弃沉淀。
7. 向上清液中加入等体积的10％（重量/体积）NaCl的，​​并搅拌30-60分钟。
离心（10,000 xg离心30分钟），弃去上清液，并重新溶解在0.25M乙酸中的沉淀物搅拌24小时，在4〜1:1的比例℃。
8. 透析的胶原蛋白溶液对6-8变化6L〜17.5 mM乙酸（1毫升冰乙酸的每公升的冷水，改变2 x每日）。
9. 离心透析的胶原蛋白以30,000 xg 1.5小时。
10. 去除上清液和在无菌烧瓶中的地方。
11. 调整的I型胶原〜2毫克/毫升的浓度在4℃下使用0.5 mM乙酸

3。第二阶段 - 建立3D矩阵与的嵌入式成纤维细​​胞（允许8天的合同）。

1. 组装在一个预冷冻瓶使用冷的试剂在4℃下混合。保持Ⅰ型胶原冰。
2. T75烧瓶融合的主要成纤维细胞（细胞数1×10 ^6）使用方法：
   • 25毫升鼠尾胶原蛋白（约浓度2mg/ml）
   • 3毫升10倍MEM
   • 0.22 M氢氧化钠：第一，加入2ml，然后下降明智的同时搅拌，直到胶原变为橙色，
   • 但不是粉红色（通常高达3毫升）。近似^P H = 7.2。
   • 注：这是重要的，以确保该介质/凝胶保持中性或微酸性的成纤维细胞也就不会收缩如果暴露于碱性条件下即使是略微的凝胶。
3. Trypsinise成纤维细胞，旋转400×g离心5分钟，弃上清。
4. 在旋转5分钟以上：准备12×35毫米的塑料菜 - 通常达到12道菜，从一个烧瓶的成纤维细胞/胶原蛋白组合。
5. 重悬，立即加入3毫升FCS的胶原蛋白混合，搅拌成纤维细胞。
6. 板约2.5毫升/成纤维细胞的胶原蛋白每道菜尽快。尽量避免气泡和胶原蛋白的设置。
7. 让胶原蛋白设定在37℃下，在湿润的5％CO ₂气氛下在空气中10分钟。
8. 加入1ml的成纤维细胞生长个介质（DMEM +10％FCS）。
9. 分离矩阵的菜用移液管从两侧的胶原蛋白/成纤维细胞。
10. 第二天：成纤维细胞生长培养基（DMEM +10％FCS）加入1ml。
11. 媒体每一天。允许胶原蛋白/成纤维细胞基质合同约8天，直到他们适合在24孔板（〜3.5厘米至1.5厘米，直径收缩，参见图1）。

注：胶原蛋白的浓度应进行调整，以满足不同应用。较稀的胶原溶液，将承包的成纤维细胞。收缩率的轻微差异，将经历不同批次的胶原蛋白在相同的浓度。同样，不同的纤维母细胞胶原凝胶收缩以不同的速率，而目前更多的成纤维细胞，更快的收缩率。胶原蛋白的浓度和成纤维细胞密度因此可以通过调整，修改的收缩率，的胶原蛋白凝胶的最终密度。

4。第二阶段 - 电镀利息细胞矩阵顶部

注意：在使用前消毒用乙醇钳和设备。

1. 使用钝镊子，轻轻将24孔板合同矩阵。确保不折。
2. 准备感兴趣的细胞的悬浮液中，在约4×10 ^4个 / ml和的板1毫升（后摆脱的胰蛋白酶的trypsinising，旋细胞）上的矩阵的顶部。实际所需的细胞数量会有所不同，这取决于所使用的细胞类型。细胞培养基中应该是所关注的细胞正常生长培养基。
3. 允许细胞生长至汇合矩阵顶部，约3-5天。

5。第三阶段 - 转移矩阵的一个网格入侵（约0-21天）

1. 切割不锈钢网格，建立一个三脚架和高压灭菌器在使用之前（参见图2）。
2. 将无菌的网格中6 cm培养皿中，生长培养基添加到网格（约10.5毫升）以上的水平。放置在网格上的矩阵，并轻轻地吸出介质，使底部的矩阵是与媒体接触，但不被水淹没。这被称为作为气/液界面，它创建了一个梯度，促进入侵。更换中等每隔两天（参见图2）。
3. 活细胞，使用荧光细胞进行成像的上下文成像，在这个阶段或更早的版本。合同或纤维状的胶原蛋白，我可以成像，二次谐波产生（SHG，参见图3）。使用多光子激发与宽视场的检测相结合，我们发现，SHG可以被成像到矩阵的至少为100微米，而表达细胞质绿色荧光蛋白的细胞可以被成像至少200微米深。

注：对于量化的入侵，被放置在网格在这一天matricies定义0天。对电网产生位置的梯度，促进细胞培养基入侵诠释 Ø矩阵。样品可以进行成像，在未来的1 - 21天（或更长），以评估生物过程，如的侵入，增殖，存活和分化（见参考文献列表）。

6。第四阶段 - 枷

1. 加入5毫升的4％PFA中的Falcon管中。
2. 转移到平坦的表面上的矩阵。切矩阵与一个新鲜干净的手术刀（因为你将染色的横截面）的一半，解除矩阵，用解剖刀和转让4％PFA固定过夜。
3. 器官的矩阵现在已经准备好与抗体染色/染色的选择（参见图3）。

7。代表性的成果：

图1实施例的成纤维细胞承包胶原I.混合料的成纤维细胞与大鼠尾胶原脱离陪替氏培养皿，并允许收缩超过6-8天。

图2“SRC =”/ files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg“/>
图2器官的试验进展。 A，器官和进展示意图，B，胶原/成纤维细胞顶部不锈钢，无菌的网格建立气/液界面上的矩阵的实施例。

图3的器官型分析中的应用。 A，B非侵入性和侵入性胰腺导管腺癌（PDAC）细胞侵入随着时间的推移与器官矩阵。C，生活呈现出分层表皮的皮肤替代物，胶原真皮成纤维细胞承包组件。D，C8161黑色素瘤细胞的成纤维细胞侵入签约胶原真皮相当于E，入侵PDAC细胞（绿色）与成纤维细胞（红色）的器官矩阵内的互动和入侵。F

讨论

在这里，我们提出了一种方法，用于生产适合于研究入侵细胞迁移^6-8的一个3 -维的矩阵。基质由第一型胶原蛋白纤维，收缩超过数天的期间，由初级人表皮成纤维细胞。胶原蛋白的制备通过酸提取，而不是酶消化，它保留在聚肽两端的反应性，并促进交联的胶原纤维成更大的聚集体中和时的缓冲液条件^9。这将导致在重新构成的凝胶更密切模仿的胶原蛋白在体内的功能，并具有重要的后果，在凝胶中培养的细胞的浸润性能。不要紧，不论是新鲜或冷冻的起始材料的使用，但使用青春期的老鼠的尾巴是很重要的，因为在年轻的动物胶原蛋白的交联更不稳定。因此，Ⅰ型胶原，从年幼的动物是比较容易提取，并重新构成瓦特第i个更高的保真度。

的胶原基质可以是固定的，和与对任何侵入性肿瘤细胞或基质成纤维细胞^2,10抗体染色，是非常有用的，用于测试的功效的药物，这可能抑制入侵^5,6。

虽然此协议建议使用初级人皮肤成纤维细胞中，可行的是使用主要从其他类型的组织的成纤维细胞，根据接受调查的组​​织类型。另外，也可以建立使用永生化的成纤维细胞，包括已稳定转染的细胞与荧光的蛋白质结合物的文化。以这种方式，基质细胞和肿瘤细胞可以标记为可视化入侵¹¹期间的细胞-细胞相互作用。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
10倍MEM	Gibco公司	21430	-
氢氧化钠	西格玛	367176-500G	准备0.22 M的股票在水
FCS	PAA实验室	A15-101	-
35 mm培养皿	鹰	353001	对于步骤3.4
60 mm培养皿	鹰	353004	对于步骤5.2
弹簧钳钝	萨姆肯	E003/02	锯齿，不平滑
16％的多聚甲醛	电子显微镜	15710	在PBS中稀释至4％，在使用前
屏幕为CD-1，大小为40目	西格玛	S07707-5EA	不锈钢网格，每包5
透析管	Medicell国际	7607 2295	12 - 14 kD的
PBS	Oxoid公司	BR0014G	-
醋酸	西格玛	242853	-
24孔板	鹰	353047	对于步骤4.1
两性霉素B	在vitrogen	15290018	-