器官型コラーゲンIアッセイ：3次元コンテキストでのセルの挙動を評価するための可鍛性プラットフォーム

要約

メソッドは、I型コラーゲンと初代ヒト線維芽細胞からなる3次元マトリックスの調製について記載されています。この器官ゲルは、それが組織の間質の基本的な機能を模倣し、顕微鏡の多くの形態が可能であるため、侵襲的な細胞遊走を評価するために有用な基質として機能します。

要約

細胞遊走は、開発、創傷治癒、免疫系の細胞応答、腫瘍細胞の転移を含む生物学の多くの側面に基本的である。移行は、光学顕微鏡で調査に従順セルラーダイナミクスを作るためにガラスカバースリップ上に研究されてきた。しかし、これは細胞遊走の多くの側面を忠実にガラスやプラスチックなどの硬質¹二次元の基板では表現されないため、その弾力性、タンパク質組成物、および細孔径など、ローカル環境の機能に依存することが明らかになってきた。さらに、間質線維芽細胞^2、免疫細胞^3を含む他の細胞型との相互作用は、癌細胞の浸潤を促進する上で重要な役割を果たすことが示されている。分子レベルでの調査がますます比較した場合、同一の細胞の薬物治療への反応を含む分子動力学は、大きく異なっていることが示されているおよび in vivoの^4インチ

理想的には、生体内でその天然に存在する文脈における細胞遊走を勉強するのがベストですが、これは常に可能とは限りません。そのような細胞由来マトリックス、マトリゲル、器官培養（ここで説明）組織外植片、オルガノイド、および異種移植片のような中間組織培養システムは、それゆえに重要な実験的な中間体である。これらのシステムは生体内環境でのおおよその特定の側面を、そのような安定的にトランスフェクトされた細胞株、薬物治療計画、長期的かつ高分解能イメージングの使用などの実験操作に対してより適している。このような中間システムは 、in vivo で ⁵イメージングを引き受ける前にプローブを検証し、イメージに細胞や蛍光レポーターの動的応答に必要なパラメータを確立するための根拠を証明として特に有用である。このように、彼らは、リヴィンの実験の必要性を低減する上で重要な役割を果たすことができるG動物。

プロトコル

1。皮膚外植片からの線維芽細胞培養の確立

1. 100単位/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、及び0.25μg/ mlのファンギゾンを補った人間の前腕から取得した4ミリメートルパンチ生検をMEMに配置されます。
2. 任意の皮下脂肪をトリミングして、細かくシャーレの底面に24番メス刃を揺動することにより、小さな断片に生検を切り刻む。
3. フラスコの表面になるまで一次性線維芽細胞増殖培地（MEM、10％FCS、100単位/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、及び25μg/ mlのファンギゾンを補充）を25cm ^2の組織培養フラスコに入れ、組織のスラリーは、追加された覆われたが、液体の深さは、組織が浮遊するのは不十分である。
4. 5％CO ₂の加湿雰囲気中で37℃で3日間インキュベート℃に続いて、プライマリー繊維芽細胞増殖培地3mlを加える。
5. 新鮮なプライマリー繊維芽細胞増殖培地を使用して別の3日間のインキュベーション変化媒体の後、またはCEL場合lsはほぼコンフルエントになる彼らは、新鮮な培地に1:4に分割されることがあります。 （ファンギゾンはこれ以降省略できます）。

2。ステージI - ラットの尾からコラーゲンIの調製

注：約12から14思春期（生鮮または冷凍）ラットの尾のためのプロトコル

1. 70％エタノールで洗浄することにより、ラットの尾を用意し、次のように腱を削除します。
2. 尾の長さに沿ってメスをむきで上から下へ尾の真ん中にスライスして、ラットの尾部から皮膚を取り除きます。
3. 尾の近位領域のコアから腱をデタッチします。
4. 歯鉗子を用いてシースを避け尾の先端領域に向かって腱を削除します。
5. 48時間4℃で撹拌することにより腱の1グラム/ 0.5 M酢酸250mlを抽出します。
6. 30分間抽出物（7,500×gで）を遠心し、ペレットを捨てる。
7. 上清にNaClを10％（w / v）の等量を追加し、30〜60分間かき混ぜる。
遠心分離（10,000×g）で、4℃で24時間撹拌した〜1:1の比率で上清を捨て、0.25 M酢酸で再溶解沈殿℃に
8. 6Lの6-8変化〜17.5 mM酢酸（冷たい水のリットル当たり1ミリリットル氷酢酸、変化2×毎日）に対してコラーゲン溶液を透析する。
9. 1.5時間、30,000 xgで透析コラーゲンを遠心分離します。
10. 無菌フラスコ内の上澄みと場所を削除します。
11. 〜2 mg / mlの濃度に私は4で0.5mMの酢酸を用い℃のコラーゲンを調整

3。ステージII - 埋め込まれた繊維芽細胞（8日間の契約を許可する）と3Dマトリックスを設定します。

1. 4時に冷たい試薬を使用してミックスを組み立てる°予冷ボトルのC。氷の上でコラーゲンIを保管してください。
2. コンフルエントプライマリー繊維芽細胞の1 T75フラスコ（〜細胞数1×10 ^6）のために使用：
   • 25mlのラット尾部コラーゲン（約2mg/mLの濃）
   • 10xの3ミリリットルMEM
   • 0.22 M NaOHを：まず最初に、コラーゲンがオレンジ色に点​​灯するまで、攪拌2ミリリットル、次に滴下しながら追加し、
   • はなく、ピンク（通常最大3ミリリットル）。おおよそのP ^H = 7.2。
   • 注：これは、少しでもアルカリ性条件にさらされると線維芽細胞がゲルにかからないように培地/ゲルは中性またはわずかに酸性のままであることを確認することが重要です。
3. 、線維芽細胞をTrypsinise ​​5分間400 xgでスピンし、上清を除去します。
4. 5分の間に、上記スピン：12×35ミリメートルプラスチック皿を準備する - 通常は線維芽細胞/コラーゲンミックスの1つのフラスコから12皿を達成。
5. 3ミリリットルFCSで線維芽細胞を再懸濁するとすぐにコラーゲンミックスに追加し、かき混ぜる。
6. プレートの約2.5ミリリットル皿当たりコラーゲン/線維芽細胞、できるだけ早く。気泡やコラーゲンの設定を避けるようにしてください。
7. コラーゲンは10分間空気中5％CO ₂の加湿雰囲気中で37℃で設定してみましょう。
8. 成長する線維芽細胞の1ミリリットルを追加目の培地（DMEM +10％FCS）。
9. ピペットを用いて皿の両側からコラーゲン/線維芽細胞マトリックスをデタッチします。
10. 次の日：繊維芽細胞増殖培地（DMEM +10％FCS）の1ミリリットルを追加します。
11. 一日おきにメディアを変更してください。彼らは、24ウェルディッシュに収まるまで、約8日間の契約にコラーゲン/線維芽細胞マトリックスを許可する（直径1.5cmに〜3.5 cmから収縮、図1を参照）。

注：コラーゲン濃度は、アプリケーションに合わせて調整する必要があります。より多くのコラーゲン溶液を希釈し、速く、それは線維芽細胞によって収縮されます。収縮率のわずかな違いは、同じ濃度でコラーゲンの異なるバッチで経験されます。同様に、種々の線維芽細胞培養は、収縮速度より速い、異なるレートであり、本より線維芽細胞のコラーゲンゲル収縮する。コラーゲン濃度および線維芽細胞密度が故にによって収縮率を変更するために調整することができ、コラーゲンゲルの、最終的な密度。

4。ステージII - マトリックスの上に興味のあるメッキ細胞

注意：使用前にエタノールですべての鉗子や機器を滅菌する。

1. 鈍鉗子を使用して、静かに24ウェルディッシュに委託行列を移動します。それが倍にしないことを確認してください。
2. マトリックスの上に約4×10 ^4個 / mlとプレート1ミリリットル（トリプシンを取り除くためtrypsinising、スピン細胞の後）に興味のある細胞の懸濁液を準備します。必要なセルの実際の数は、使用する細胞の種類によって異なります。細胞培地は、目的の細胞の正常な増殖培地である必要があります。
3. 細胞は約3〜5日、マトリックスの上に合流に成長することができます。

5。ステージIII - 侵略のためのグリッド（約0から21日）に行列を転送

1. 三脚を作成します（図2を参照してください）​​使用前にオートクレーブにステンレス鋼の格子を切った。
2. に滅菌グリッドを配置6cmディッシュには、グリッド上のレベル（約10.5ミリリットル）に増殖培地を追加します。場所は、グリッド上の行列と行列の底がメディアに接触しているが、水没しないように静かに培地を吸引。これは、侵略を推進してグラデーションを作成し、空気/液体界面、と呼ばれています。 （図2を参照）は2日ごとに培地を交換してください。
3. 細胞を生き、蛍光細胞を用いた文脈イメージングは​​、この段階またはそれ以前のバージョンで画像化することができる。委託または線維性コラーゲンは、私は第二高調波発生（SHG、図3を参照）を使用して画像化することができる。我々は細胞質GFPを発現する細胞は、少なくとも200μmの深い撮像することができる一方、SHGは、マトリックス内に少なくとも100μmを撮像することができることがわかり、広い視野検出と組み合わせた多光子励起を用いた。

注：浸潤の定量化に関して、matriciesがグリッド上に配置された日を0日を定義します。グリッド上の配置は、侵略のintを促進する細胞培養培地のグラデーションを生成行列をO。 （参考文献一覧表を参照）などの侵入、増殖、生存や分化などの生物学的プロセスを評価するために、21日（またはそれ以上） - サンプルは、次の1の上に結像させることができる。

6。ステージIV - ギャグ

1. ファルコンチューブに4％PFAの5ミリリットルを追加します。
2. 平らな表面に行列を転送します。新鮮なきれいなメス（あなたは断面を染色されるように）と半分に行列を切り取り、一晩固定し、メス、4％PFAへの転送で行列を持ち上げる。
3. 器官の行列になりました（図3参照）選択抗体/染色で染色する準備が整いました。

7。代表の結果：

図線維芽細胞とシャーレから切り離されて6-8日以上の契約を許可ラット尾部コラーゲンの線維芽細胞の契約コラーゲンIの混合物の1例 。

図2は "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/>
2器官アッセイの進行を示しています。セットアップ、器官の概略と進行B、ステンレス鋼の上にコラーゲン/線維芽細胞マトリックスの例は、空気/液体界面を作成するための無菌グリッド。

器官型アッセイの3アプリケーションを示しています。 A、B、非侵襲的および侵襲性膵管腺癌（PDAC）細胞が器官行列で時間をかけて侵入C、線維芽細胞、契約コラーゲン真皮成分で層状表皮を示す皮膚等価物を生きD、線維芽細胞に侵入C8161メラノーマ細胞はコラーゲン真皮同等E、器官マトリックス内に相互作用し、線維芽細胞（赤）と侵略侵襲PDAC細胞（緑）縮小した。Fは 、分解周囲の細胞外マトリックスとの相互作用侵襲PDAC細胞（緑）（紫）多ベースの第二高調波発生を用いて可視化した。

ディスカッション

ここでは、侵襲的な細胞遊走^6-8の研究に適した3次元マトリックスの産生するための方法を提示する。行列は初代ヒト表皮繊維芽細胞によって数日間にわたって契約しているコラーゲンタイプ1線維で構成されています。コラーゲンは、ポリペプチドの両端に反応性を保持し、バッファー条件⁹を中和する際に大きな凝集体にコラーゲン線維の架橋を促進する酸抽出ではなく、酵素消化することにより調製される。より密接に、生体内でのコラーゲンの機能を模倣し、ゲル中で培養した細胞の浸潤特性にとって重要な意味を持って再構成し、ゲル中のこの結果。コラーゲンの架橋は、若い動物ではより不安定であるので、それが新鮮または凍結出発物質が使用されているかどうかは重要ですが、思春期のラットの尾を使用しないことが重要です。若い動物からコラーゲンIはw従って抽出することが容易であり、再構成i番目に高い忠実度。

コラーゲンマトリックスを固定し、染色し浸潤性腫瘍細胞又は間質線維芽細胞^2,10のいずれかに対して向けられた抗体を用いて^5,6および浸潤^を抑制^する可能性^がある薬剤の有効性をテストするために非常に有用であることができます。

このプロトコルは、初代ヒト皮膚線維芽細胞の使用を示唆しているが、それは調査対象組織の種類に応じて、他の組織型からプライマリー繊維芽細胞を使用することが可能である。それが安定して蛍光タンパク質複合体でトランスフェクトされた細胞を含む不死化線維芽細胞を用いて、文化を確立することも可能です。このように両方のストローマ細胞と腫瘍細胞が浸潤¹¹時の細胞間相互作用を可視化するためにラベルを付けることができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
10xのMEM	ギブコ	21430	-
NaOHを	シグマ	367176-500G	水に0.22 Mのストックを準備
FCS	PAAラボラトリーズ	A15-101	-
35ミリメートル皿	ファルコン	353001	ステップ3.4の
60ミリメートル皿	ファルコン	353004	ステップ5.2の
春鉗子鈍	サムコ	E003/02	スムーズではありません、歯
16％パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡のサービス	15710	使用前にPBS中の4％に希釈
CD-1、サイズ40メッシュのスクリーン	シグマ	S07707-5EA	ステンレススチールグリッド、パックごとに5
透析チューブ	Medicell国際	7607 2295	12から14 kDの
PBS	オキソイド	BR0014G	-
酢酸	シグマ	242853	-
24ウェルディッシュ	ファルコン	353047	ステップ4.1の
ファンギゾン	vitrogenで	15290018	-