在细菌粘附的研究剪应力

摘要

在感染过程中，一个关键的步骤是病原体与宿主细胞的粘附。在大多数情况下，粘附步骤发生在流动的液体所产生的机械应力的存在。我们描述了一种技术，细菌粘附的研究中的一个重要参数引入剪应力。

摘要

在细菌感染的病原体及其宿主之间发生的相互作用序列。细菌粘附到宿主细胞表面往往是最初的发病机制和步骤。虽然大多在静态条件下研究实验附着力附着力实际上是在流动的液体的存在。细菌和他们的主人之间的第一次接触，经常会出现水平的粘膜，口腔，肺，肠，眼，等上皮细胞表面的粘液沿流动。后来，在感染，病原体偶尔访问的血液循环，导致危及生命的疾病，如败血症，败血症和脑膜炎。这些感染的一个定义特征是这些病原体与血管内皮细胞在血液循环的存在交互能力。流动的液体，粘液或血液，例如存在，决定粘连，因为它会产生对病原体的机械力。为了描述流动的液体之一的效果通常是指剪应力，这是一个固定的墙附近的一个移动流体，达因^/厘米2表示每单位面积所施加的切向力的概念。剪应力强度有很大的不同根据不同船只的类型，大小，器官，位置等（0-100达因/厘米^2）。毛细血管的循环，可以达到非常低的剪应力值，甚至暂时停止期，在几^秒钟之间到几分钟1的。在频谱剪应力在动脉的另一端，可以达到100达因^/厘米2。剪应力在不同的生物过程的影响已清楚地表明，例如在白细胞与^内皮细胞的3的相互作用。要考虑到这种细菌粘附过程中的机械参数，我们^利用了基于4室使用一次性流的实验过程。宿主细胞是生长在流室，荧光细菌注射泵控制流量介绍。我们最初集中在细菌病原体脑膜炎奈瑟菌 ，革兰氏阴性菌败血症和脑膜炎等负责调查。这里描述的步骤，使我们能够研究细菌的能力的剪应力的影响：坚持细胞¹列，增殖和细胞表面^上的5 ^分离殖民6（图1）新的站点。补充的技术资料中可以找到参考文献7。这里介绍的剪应力值分别为选择基于我们以往的经验，并表示在文献中找到的值。该协议应适用于广泛的病原体根据研究目标的具体调整。

研究方案

1。人类宿主细胞和细菌培养

1. 文化脐静脉内皮细胞之间的通道1和5％（V / V）的CO ₂培养箱在37 ° 9。通道的细胞，他们的做法与胰蛋白酶/ EDTA 80％汇合时提供75厘米的培养瓶和一次性流室（μ-幻灯片六）实验文化维护文化。
2. 退出要传代培养瓶的培养基，用10毫升的PBS洗细胞，撤回和更换1.5毫升的胰蛋白酶/ EDTA。允许细胞在细胞培养孵化器分离5分钟在37 ° C。
3. 收集细胞培养液10毫升到15毫升收集管的细胞。一个5分钟的离心沉淀细胞（200克），在室温下。暂停4毫升内SFM辅以10％的细胞（V / V）FBS和计数上Malassez腔，根据制造商的指示。
4. 引入通道（3X10共^4个 ）30一个1 × 10 ⁶ HUVEC细胞每毫升悬浮液，并允许坚持3个小时的细胞在培养箱在37 ° 5％（V / V）的CO ₂的气氛。添加一个额外体积为120μL内SFM填补了井。细胞应形成subconfluent的单层（图2）。
5. 成长N。脑膜炎表达GCB琼脂含有凯洛格的补充和5在37微克/毫升的氯霉素°在一个潮湿的含有5％的气氛彗星（V /板绿色荧光蛋白（在这种情况下的应变8013表达一个IPTG的诱导启动子控制下的GFP）， V）CO ₂为16小时。

2。个别细菌的初始粘附到宿主细胞

1. 调整预热远藤- SFM包含120分钟的10％（V / V）FBS和孵化在37 °在潮湿的大气中含有5％（V /彗星OD600值0.05 GCB琼脂平板上生长的细菌含量V）CO _2，下轻轻摇动（130转）。整个孵化期的培养基中加入1 mM的IPTG的诱导GFP的表达。
2. 放在倒置显微镜配备了激烈的平台，样品的温度保持在37 ° C。阶段一次性μ- SLIDE
3. 无菌玻璃烧杯倒入预热远藤- SFM辅以2％（V / V）胎牛血清和填充50毫升无菌注射器，这种媒介。将“进入”管注射器和填写引入介质。
4. 连接“入口”的μ- SLIDE油管，小心，以避免空气进入墓室。然后，贴上“退出”管的另一端，并认真填写渠道中“退出”室约1厘米的距离。
5. 测量细菌的OD600值和内SFM含有2％（V / V）FBS的调整到0.15。为了寻找个别细菌必须被打乱，任何聚集的细菌样本的蓬勃震荡。
6. 广场100μL内SFM进了水库，并辅以2％（V / V）FBS的培养基，添加100μL细菌的解决方案采取的振荡的解决方案，以避免采样任何剩余的细菌总量的顶部。
7. 小心地转动活塞腔注入细菌引入到μ-幻灯片200μL体积。
8. 引进内SFM含2％（V / V）FBS的，保持在37 °加热平台，进入会议厅使用注射泵剪应力兼容0.044达因/厘米² 15分钟的附着力。

例如，请参阅视频1或图3。这一步后，可以移动到第3，4或6。

3。个别细菌的初始粘附宿主细胞的定量

1. 经过15分钟的初始粘附，十个领域获得的图像随机，而液体至今仍流传。
2. 分析获得的图像，使用ImageJ ^软件 8，以访问adherant细菌每场平均人数。这样做如下：首先，每个图像使用的“门槛”窗口，在“图像”菜单中找到，同时最大限度地从细胞中的背景，以突出个人坚持的荧光细菌阈值。然后，每一个单一的细菌也计算在内，通过使用插件“细胞计数” （ http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html） 。每幅图像的数据报告在Excel电子表格，并平均量化附着细菌每场平均人数。

4。测量电阻，个别细菌附着在宿主细胞流

1. 计划注射泵设置产生剪应力，从3到100达因/ ^厘米 2 5分钟。
2. 在5分钟结束时，获得随机选择步骤3.1中所述的10个领域，但与流动停止PRIOR到收购。
3. 步骤3.2中所述的分析获得的图像和量化平均每场剩余的细菌数量。

5。测量一个孤立的附着细菌的生长到microcolony

1. 引进内SFM含10％（V / V）胎牛血清，保持在37 ° C，加热平台进入会议厅使用注射泵与所选择的几个小时的剪应力。为每5分钟一帧的实时视频显微镜图像记录。
2. 下面的视频显微镜，停止关闭注射泵的剪应力，获得2-3额外的图像，然后停止该软件的图像采集序列。细菌繁殖的一个例子可以看出，在视频2。

6。测量电阻附着细菌microcolonies的流动

1. （step5.2）收购后的细胞表面形成大microcolonies流应用程序的前2-3图像的两种细胞（相位相反）和细菌（GFP荧光）。其余实验，收购协议将只监视的荧光。
2. 高剪切力，在每5秒一帧为5分钟（3-100达因/ ^厘米 2），并记录图像中的应用。
3. 停止关闭注射泵的剪应力，获得2-3额外的图像，然后停止对软件的图像采集序列。
4. 接下来，删除第一个“退出”管，仔细，避免排空的通道，然后添加新鲜培养基预热，以填补之前删除“进入”管的井。
5. 为了定量确定的剪应力的作用，对细菌耐药性，可进行电镀实验如下：收集剩余的介质，并用120μL的PBS，删除剩余的介质通道（都洗两次的μ- SLIDE还收集了）。
6. 分离感染的细胞在37℃5分钟与50μL胰蛋白酶/ EDTA此外，在上一步所收集的暂停和混合分离样品。
7. 执行连续稀释在PBS和板10μL分数到GCB琼脂平板上，一式三份，以确定第二天的菌落形成单位（CFU）的板孵化后，在37 ° C的孵化器5％（V / V）的CO _2。

影片3和4比较淠绿突变体与野生型菌株。

7。细菌支队从microcolonies

1. 感染细胞在流动腔重复步骤2.1至2.8，并允许进行30分钟的感染。
2. 一段2分钟的流量增加至10达因/ ^厘米 2，删除未绑定的细菌，使感染继续为2h。
3. 减少流量0.15达因/厘米^2。
4. 每隔一小时，收集流室，中型下降。
5. 执行系列稀释样品和GCB琼脂平板上板他们。
6. 确定第二天的菌落形成单位（CFU）的，板块的孵化后在37℃的孵化器C的5％（V / V）的_CO 2 。

8。代表性的成果

图1：在流动过程中的存在，可以观察和测量的一个细胞单层的不同步骤。

图2：在实验（剪应力的情况下）开始在流动腔的内皮细胞单层。约50内皮细胞组织在子汇合单层。

图3：初步粘附细菌的细胞表面上的图形表示。三个字段的值是表示磁场对磁场的变化，预计（0044达因/ ^厘米 2）的想法。

视频1。初始的细菌粘附细胞单层作为时间的函数（0044达因/厘米^2）可视化。表达GFP的细菌以下的流动介质的方向。这部电影是加快了60倍，真正的视频持续时间为10分钟。
点击这里观看视频。

视频2，经过初步粘附的细菌。被允许细胞表面上的增殖期为7小时（加速1000倍）。
点击这里观看视频。

视频3。细胞表面上的机械师，后扩散剪应力水平增加5分钟，但野生型microcolonies耐加速60倍到10达因/厘米²人microcolonies阻力进行了测试。
点击这里观看视频。

由淠绿突变体形成的视频 4。Microcolonies被打乱流量的增加（10达因^/厘米2 ）。这种突变失败诱导质膜下microcolonies重塑，从而更高度敏感，增加剪应力（视频加速60倍^）5。
点击这里观看视频。

讨论

剪应力，一般在生物力学方面的重要性正日益被人们所认识。例如高度适应胶粘剂的选择素家族的蛋白质在细胞粘附和血管壁的滚动过程中已确认的过程中通过引入剪应力。上文所述的程序，适用于革兰氏阴性菌的脑膜炎奈瑟菌，但应适用于广泛的病原体。也为其他​​病原体和其他感染部位的剪应力的重要性已被证明。细菌粘附剪应力的条件下已经FimH黏附研究发现肾盂肾炎大肠杆菌^（UPEC） 9。类似选择素，被证明是由剪切引起的机械力和CfaE 肠毒素大肠杆菌黏附加强FimH和其宿主细胞受体之间的相互作用也有报道调解肠上皮细胞的粘附，通过剪切依赖性机制^10。我们报道，使用的层流室，无乳链球菌菌毛为流动条件下的上皮^细胞 11坚持这种病菌是至关重要的本章中描述的实验协议。这些研究证实，我们的流室法是一个有用的工具，调查宿主细胞病原体相互作用的剪应力条件下。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号
μ- SLIDE VI 0.4流试剂盒	IBIDI	80606
注射器Plastipak 50毫升鲁尔锁	碧迪	300865
聚乙烯管材R3603 3.2 ×4.8毫米	费雪的科学	R3603
3路阀，2名女露儿男性露儿	Bio - Rad公司	7328103
注射泵	哈佛器械	博士2000
倒置显微镜，尼康	尼康	Eclipse T I的
CCD相机	滨松	ORCA的285 CCD或ORCA的3 - CCD
ImageJ软件	国立卫生研究院	软件 （ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）