L'introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

Riepilogo

Durante il processo di infezione, un passo fondamentale è l'adesione di patogeni con cellule ospiti. Nella maggior parte dei casi questo passo adesione avviene in presenza di sollecitazioni meccaniche generate dal flusso liquido. Descriviamo una tecnica che introduce sforzo di taglio come un parametro importante nello studio della adesione batterica.

Abstract

Durante le infezioni batteriche una sequenza di interazioni avvengono tra il patogeno e il suo ospite. Adesione batterica alla superficie della cellula ospite è spesso il primo passo e la determinazione della patogenesi. Anche se in via sperimentale l'adesione è per lo più studiati in condizioni statiche adesione avviene concretamente in presenza di liquido che scorre. Primi incontri tra batteri e il loro ospite spesso si verificano a livello delle mucose, bocca, polmoni, intestino, occhio, ecc muco dove scorre lungo la superficie delle cellule epiteliali. Più tardi, nel infezione, agenti patogeni di tanto in tanto l'accesso la circolazione del sangue che causano malattie letali come la setticemia, sepsi e meningite. Una caratteristica essenziale di queste infezioni è la capacità di questi patogeni di interagire con le cellule endoteliali in presenza di sangue circolante. La presenza di liquido che scorre, muco o di sangue, per esempio, determina l'adesione perché genera una forza meccanica sul patogeno. Per caratterizzare l'effetto di un liquido che scorre di solito si riferisce alla nozione di sforzo di taglio, che è la forza tangenziale per unità di superficie esercitata da un fluido in movimento vicino ad una parete fissa, espressa in dyne / cm ^2. Intensità di sforzo di taglio variano ampiamente a seconda del tipo diversi vasi, le dimensioni, organo, posizione ecc (0-100 dyne / cm ^2). Circolazione nei capillari può raggiungere valori molto bassi shear stress e anche interrompere temporaneamente durante i periodi che vanno da pochi secondi a diversi minuti ^1. All'altra estremità dello spettro di sollecitazione di taglio nelle arteriole può raggiungere i 100 dyne / cm ^{2 2.} L'impatto dello stress di taglio sui diversi processi biologici è stato chiaramente dimostrato come ad esempio durante l'interazione dei leucociti con l'endotelio ^3. Per tenere conto di questo parametro meccanico nel processo di adesione batterica abbiamo approfittato di una procedura sperimentale basata sull'utilizzo di un flusso monouso camera ^4. Cellule ospiti sono coltivate in camera di flusso e batteri fluorescenti vengono introdotti nel flusso controllato da una pompa a siringa. Inizialmente abbiamo concentrato le nostre indagini sul patogeno batterico Neisseria meningitidis, un batterio Gram-negativo responsabile della setticemia e la meningite. La procedura descritta qui ci ha permesso di studiare l'impatto dello stress di taglio sulla capacità dei batteri di: aderire alle cellule ^1, a proliferare sulla superficie cellulare ⁵ e di staccare di colonizzare nuovi siti ⁶ (Figura 1). Complementare informazioni tecniche si trovano in riferimento 7. Valori di shear stress qui presentate sono state scelte in base alle nostre esperienze precedenti ¹ e per rappresentare i valori trovati in letteratura. Il protocollo dovrebbe essere applicabile a una vasta gamma di agenti patogeni con aggiustamenti specifici a seconda degli obiettivi dello studio.

Protocollo

1. Della cellula ospite umano e coltura batterica

1. HUVECs cultura passaggio tra 1 e 9 a 37 ° in un incubatore umidificato con il 5% (v / v) di CO _2. Passaggio delle cellule quando si avvicinano l'80% confluenza con tripsina / EDTA per fornire culture manutenzione su 75 cm ² fiaschi cultura e delle culture sperimentali in camere a flusso monouso (μ-Slides VI).
2. Ritirare media dai contenitori da diversi passaggi, lavare le cellule con 10 ml di PBS, ritirare e sostituirlo con 1,5 ml di tripsina / EDTA. Permettono alle cellule di staccare in una coltura cellulare incubatore per 5 minuti a 37 ° C.
3. Raccogliere le cellule con 10 ml di mezzo di coltura cellulare in una provetta da 15 ml di raccolta. Agglomerare le cellule con una centrifugazione 5 minuti (a 200 g), a temperatura ambiente. Sospendere le cellule in 4 ml di Endo-SFM supplementato con 10% (v / v) di FBS e contare su una camera di Malassez, secondo le istruzioni del produttore.
4. Introdurre 30 ml di uno 1x10 ⁶ cellule HUVEC per ml di sospensione nel canale (3x10 ^{4 in} totale) e permettono alle cellule di aderire per 3 ore a 37 ° in un incubatore umidificato con un'atmosfera del 5% (v / v) di CO _2. Aggiungere un volume aggiuntivo di 120 ml di Endo-SFM a riempire i pozzi. Le cellule dovrebbero formare un monostrato subconfluent (Figura 2).
5. Crescere N. meningitidis che esprimono GFP (in questo caso ceppo 8013 GFP che esprimono sotto il controllo di un IPTG-inducibile promotore), su piastre di agar GCB contenente Kellogg integratori e 5 mg / ml di cloramfenicolo a 37 ° C in atmosfera umida contenente il 5% (v / v) di CO ₂ per 16 ore.

2. Adesione iniziale di batteri individuali di ospitare le cellule

1. Regolare la concentrazione di batteri coltivati ​​su piastre di agar GCB ad un OD600 di 0,05 con pre-riscaldato Endo-SFM contenente il 10% (v / v) di FBS e incubare per 120 minuti a 37 ° C in atmosfera umida contenente il 5% (v / v) di CO _2, in agitando delicatamente (130 giri). Indurre l'espressione GFP con l'aggiunta di 1 mM IPTG nel terreno di coltura per l'intero periodo di incubazione.
2. Posizionare la usa e getta μ-Slide sul palcoscenico di un microscopio invertito dotato di una piattaforma riscaldata per mantenere la temperatura del campione a 37 ° C.
3. Versare preriscaldata Endo-SFM integrato con il 2% (v / v) FBS in un bicchiere di vetro sterile e riempire una siringa sterile da 50 ml con questo mezzo. Collegare il tubo "voce" alla siringa e riempire con l'introduzione di mezzo.
4. Collegare il tubo "voce" al μ-Slide, con cura, al fine di evitare l'introduzione di aria nella camera. Poi, apporre il tubo "uscita" verso l'altra estremità e compilare accuratamente il canale con medie di circa 1 cm di distanza dalla "uscita" da camera.
5. Misurare la OD600 batterica e regolare a 0,15 in Endo-SFM contenente il 2% (v / v) di FBS. Per guardare i batteri individuale qualsiasi aggregati deve essere interrotto da vortex vigorosa del campione batterica.
6. Posto 100 l di Endo-SFM integrato con il 2% (v / v) FBS medio nel serbatoio e aggiungere 100 microlitri della soluzione batterica presa dalla cima della soluzione in agitazione per evitare di campionamento ogni aggregati rimanenti batterica.
7. Con attenzione introdurre il volume di 200 microlitri nel μ-Slide girando il rubinetto per iniettare i batteri nella camera.
8. Introdurre Endo-SFM contenente il 2% (v / v) di FBS, mantenuto a 37 ° C con la piattaforma riscaldata, nella camera usando una pompa a siringa con un sforzo di taglio compatibile con l'adesione del 0,044 dyne / cm ² per 15 minuti.

Vedere il video per 1 o esempio la figura 3. Dopo questo passaggio, spostare le sezioni 3, 4 o 6.

3. Quantificazione di adesione iniziale di batteri individuali per le cellule ospiti

1. Dopo l'adesione iniziale per 15 minuti, acquisire immagini di dieci campi in modo casuale mentre il liquido è ancora in circolazione.
2. Analizzare le immagini acquisite utilizzando il software ImageJ ^8, al fine di accedere al numero medio di batteri adherant per campo. Questo avviene nel seguente modo: prima di tutto, ogni immagine è thresholded utilizzando la finestra "Soglia" che si trova nel menu "Immagine" per evidenziare i singoli batteri aderiscono fluorescenti, riducendo al minimo lo sfondo dalle cellule. Poi, ogni singolo batterio viene conteggiato, utilizzando il plug-in "Counter Cell" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). I dati per ogni immagine sono riportate in un foglio di calcolo Excel e viene calcolata la media di quantificare il numero medio di batteri aderenti per campo.

4. Misurare la resistenza al flusso dei batteri singoli aderenti a cellule ospiti

1. Programmare il siringa pompa set-up per generare sollecitazioni di taglio che vanno dal 3-100 dyne / cm ² per 5 minuti.
2. Al termine dei 5 minuti, acquisire dieci campi scelti a caso come descritto al punto 3.1, ma con il flusso interrotto prIOR per l'acquisizione.
3. Analizzare le immagini acquisite come descritto al punto 3.2 e quantificare il numero medio di batteri rimasti per campo.

5. Misurare la crescita di un batterio isolato aderente ad un microcolony

1. Introdurre Endo-SFM contenente il 10% (v / v) di FBS, mantenuto a 37 ° C con la piattaforma riscaldata, nella camera usando una pompa a siringa con lo stress di taglio scelto per diverse ore. Registrare le immagini in tempo reale la microscopia video un fotogramma ogni 5 minuti.
2. A seguito di microscopia video, fermare la sollecitazione di taglio, spegnendo la pompa a siringa, acquisire 2-3 immagini aggiuntive e quindi interrompere la sequenza di acquisizione delle immagini sul software. Un esempio di proliferazione batterica può essere visto sul video 2.

6. Misurare la resistenza al flusso di aderenti microcolonie batterica

1. Dopo la formazione di grandi microcolonie sulla superficie cellulare (step5.2) 2-3 acquisire immagini di entrambe le cellule (per contrasto di fase) e batteri (da GFP-fluorescenza) prima dell'applicazione di flusso. Per il resto dell'esperimento, il protocollo di acquisizione monitorare solo la fluorescenza.
2. L'applicazione di elevate sollecitazioni di taglio per 5 minuti (300-100 dyne / cm ²⁾ e registrare le immagini ad un frame ogni 5 secondi.
3. Interrompere la tensione di taglio, spegnendo la pompa a siringa, acquisire 2-3 immagini aggiuntive e quindi interrompere la sequenza di acquisizione delle immagini sul software.
4. Quindi, rimuovere il tubo di "uscita" prima e con attenzione, per evitare lo svuotamento del canale e quindi aggiungere preriscaldato mezzo fresco di riempire i pozzi prima di rimuovere il tubo "voce".
5. Per determinare quantitativamente l'effetto della sollecitazione di taglio sulla resistenza dei batteri, un saggio di placcatura può essere eseguita come segue: raccogliere i media residua e lavare la μ-Slide due volte con 120 ml di PBS, che rimuove il medium rimanenti dal canale (entrambi i lavaggi sono ) anche raccolti.
6. Staccare le cellule infettate con l'aggiunta di 50 ml di tripsina / EDTA per 5 minuti a 37 ° e mescolare il campione staccato con la sospensione raccolti nel passaggio precedente.
7. Effettuare diluizioni seriali in PBS e piastra a 10 microlitri frazione su piastre di agar GCB, in triplice copia, al fine di determinare il numero di unità formanti colonia (CFU) il giorno seguente, dopo incubazione delle piastre a 37 ° C in un incubatore con 5% (v / v) di CO _2.

Video 3 e 4 confrontare il ceppo wild type con il mutante pilV.

7. Distacco batterica microcolonie

1. Infettare le cellule nella camera di flusso ripetendo i punti da 2.1 a 2.8 e permettere l'infezione procede per 30 minuti.
2. Rimuovere i batteri non legato aumentando il flusso a 10 dyne / cm ² per un periodo di 2 minuti e lasciare infezione proseguire per 2 ore.
3. Ridurre il flusso a 0,15 dyne / cm ^2.
4. Ogni ora, raccogliere una goccia di media uscendo dalla camera di flusso.
5. Effettuare diluizioni seriali dei campioni e la piastra di loro su piastre di agar GCB.
6. Determinare il numero di unità formanti colonia (CFU) il giorno seguente, dopo incubazione delle piastre a 37 ° C in un incubatore con il 5% (v / v) di CO _2.

8. Rappresentante risultati

Figura 1: fasi differenti di un monostrato cellulare che può essere osservato e misurato in presenza di flusso della procedura.

Figura 2: monostrato di cellule endoteliali nella camera di flusso all'inizio di un esperimento (assenza di sforzo di taglio). Circa 50 le cellule endoteliali sono organizzati in una sub-confluenti monostrato.

Figura 3: Rappresentazione grafica di adesione iniziale dei batteri sulla superficie cellulare. Valori per i tre campi sono indicati per dare un'idea del campo a campo di variazione che si prevede (0044 dyne / cm ^2).

Video 1. Visualizzazione di adesione iniziale di batteri sulla monostrato cellulare in funzione del tempo (0044 dyne / cm ^2). GFP-esprimere i batteri stanno seguendo la direzione del flusso del fluido. Il film è accelerato 60 volte, la durata reale del video è di 10 minuti.
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Video 2. Dopo i batteri adesione iniziale è stato permesso di proliferare sulla superficie cellulare, per un periodo di 7 ore (accelerato 1000-fold).
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Video 3. Dopo proliferazione sulla superficie cellulare il meccanicoresistenza al di microcolonie è stato testato aumentando il livello di sollecitazione di taglio a 10 dyne / cm ² per 5 minuti, ma microcolonie wild-type sono resistenti accelerato di 60 volte.
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Microcolonie video 4. Formata dal mutante pilV sono interrotti da aumentare il flusso (10 dyne / cm ^2). Questo mutante non riesce a indurre il rimodellamento della membrana plasmatica in microcolonie ed è quindi molto più sensibile alle sollecitazioni di taglio maggiore (il video è accelerato di 60 volte) ^5.
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Discussione

L'importanza della sollecitazione di taglio e, in generale degli aspetti meccanici in biologia è sempre più riconosciuto. Per esempio le proprietà altamente adattato adesivo della famiglia selectina di proteine ​​nel processo di adesione dei linfociti e rotolare sulla parete vascolare è stato riconosciuto con l'introduzione di shear stress nel processo. La procedura sopra descritta è stata applicata al batteri Gram-negativi Neisseria meningitidis, ma dovrebbe essere applicabile a una vasta gamma di agenti patogeni. L'importanza della sollecitazione di taglio è stato dimostrato anche per altri patogeni e altri siti di infezione. Adesione batterica condizionata da shear stress è stato descritto dallo studio del adesina FimH trovato su Escherichia coli uropatogeni (UPEC) ^9. Simile a selectine, l'interazione tra FimH e del suo recettore della cellula ospite ha dimostrato di essere rafforzata da forze meccaniche di taglio indotta ⁹ e il adesina CfaE di enterotossigena E.coli è stata segnalata anche a mediare l'adesione a cellule epiteliali intestinali attraverso un taglio-dipendente meccanismo ^10. Abbiamo segnalato, con il flusso laminare protocollo del saggio camera descritto in questo capitolo che Streptococcus agalactiae pili erano essenziali per il rispetto di questo patogeno alle cellule epiteliali in condizioni di flusso ^11. Questi studi confermano che il nostro saggio camera di flusso è uno strumento utile per lo studio della cellula ospite-patogeno interazioni in condizioni di stress di taglio.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
μ-Slide VI 0,4 kit di flusso	IBIDI	80606
Plastipak siringa da 50 ml Luer-Lock	Becton Dickinson	300865
Tubo Tygon R3603 3,2 x 4,8 millimetri	Fisher-Scientifico	R3603
Rubinetto a 3 vie, 2 luer femmina a maschio luer	Bio-Rad	7328103
Pompa siringa	Harvard Apparatus	PHD 2000
Microscopio invertito, Nikon	Nikon	Eclipse T i
CCD	Hamamatsu	ORCA 285 CCD o ORCA 3-CCD
ImageJ software	NIH	Gratuito ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )