监测劈开caspase - 3活性和钾诱导膜去极化使用活细胞成像和Cleaveable荧光染料基板的永生的少突胶质细胞凋亡

摘要

活细胞成像的caspase - 3介导的细胞凋亡，永生N19少突胶质细胞培养使用 NucView 488的caspase - 3基板。这种技术适用于多种类型的细胞和组织细胞程序化死亡实时检测。

摘要

中枢神经系统可经验的强调和神经系统的侮辱，它可以有许多不利影响，减少神经元的人口和功能，最终导致数量。受损的轴突可以释放分子，包括钾或到细胞外基质，这反过来，可以产生进一步的侮辱和伤害，包括星形^细胞和少突胶质细胞8，16支持神经胶质细胞谷氨酸兴奋。如果侮辱仍然存在，细胞会进行程序性细胞死亡（凋亡），这是规范和激活一些行之有效的信号转导^级联 14 。细胞凋亡和组织坏死后可出现脑外伤，脑缺血和癫痫发作。细胞凋亡调控的一个经典的例子就是家庭的依赖半胱氨酸天冬氨酸指示蛋白酶，或凋亡。包括caspases的活性蛋白酶也被牵连在慢性神经细胞死亡退行性疾病包括阿尔茨海默氏症，亨廷顿氏，和多发性硬化症^{4，14，3，11，7。}

在这个协议中，我们描述 NucView 488 caspase - 3的基板来衡量的caspase - 3的永生N19，少突胶质细胞（OLG）细胞^{培养15日，5}介导的细胞凋亡率，暴露于高浓度，如不同外讲钾或谷氨酸。有条件永生N19 OLG细胞株（代表O2A祖）获得的安东尼Campagnoni博士（加州大学洛杉矶分校塞梅尔神经科学研究所^{），15，5，}和先前已用于研究髓鞘基因表达和信号转导的领先的分子机制OLG分化（如^6，10）。我们发现这种细胞系转染外源性髓鞘碱性蛋白（MBP）的强劲构造融合RFP或GFP（红色或绿色荧光蛋白^）13 ，12。在这里，N19 - OLG细胞培养治疗，为80毫米氯化钾或100毫米的谷氨酸钠模仿轴突漏到细胞外基质诱导^细胞凋亡9。我们用一个双功能的caspase - 3基板包含一个DEVD（ASP - GLU - VAL - ASP）Caspase - 3识别亚基与DNA结合染料^2。基板迅速进入细胞质中，它是由细胞内的caspase - 3裂解。 NucView 488染料，被释放并进入细胞核，它在488 nm的结合DNA和绿色荧光，信号凋亡。 NucView 488 Caspase - 3底物允许使用活细胞成像实时^1，10。在这段视频中，我们还描述了不朽的N19 - OLG细胞的培养和转染，以及活细胞成像技术。

研究方案

1。解冻和培养细胞

1. 获取股票冻结永生N19的少突胶质细胞从长期液氮存储。
2. 浸入小瓶含有细胞在37℃水浴，直到完全解冻的细胞悬液。
3. 添加7毫升（贝科的改良Eagle培养基）的DMEM高糖补充与10％FBS（胎牛血清）和1％青霉素/链霉素10厘米的培养板。
4. 添加下拉明智的板块，并轻轻搅拌和岩石的Petri板均匀分散的细胞的细胞悬浮。
5. 在34 ° C / 5％CO ₂培养箱培养细胞。
6. 4小时后，从板的吸媒体删除任何剩余的DMSO（二甲基亚砜），已作为冷冻保护剂的使用，并取代与新媒体（7毫升的DMEM高糖媒体与10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素） 。

2。传代细胞

1. 在70-80％合流（4-7天增长），从细胞吸媒体。
2. 加入1毫升的0.25％胰蛋白酶板块。移液器胰蛋白酶分离细胞（约5分钟）。
3. 实验条件，并通过一个额外的10厘米板未来的实验在细胞密度不小于0.1 × 10 ⁶细胞/毫升适当稀释。

注意：您应该通过使用实验前解冻后的细胞至少两次。

3。细胞计数和电镀

1. 对活细胞成像板细胞，trypsinize如前所述。
2. 取出约30μL细胞计数使用一个血球。
3. 将在6孔板无涂层的玻璃盖玻片。以及细胞密度为0.1 × 10 ⁶细胞/ ml与10％FBS和1％青霉素/链霉素，在34 ° C / 5％CO ₂补充，在2毫升苯酚的DMEM高糖媒体。
4. 允许细胞生长过夜（16-20小时）在34 ° C / 5的转染前_2％的二氧化碳。

4。转

1. 将100μL的无血清培养基，0.5-4微克纯化的质粒DNA，和4μL，FuGENE HD（罗氏）。涡流轻轻混合。
2. 涡再次简要，并允许在室温下5分钟到复杂的DNA，然后添加FuGENE HD DNA混合物直接向培养细胞。倾斜板，轻轻地混合。
3. 文化的细胞在34 ° C / 5％的CO ₂的待遇或实验前一个额外的48小时。

5。准备活细胞成像细胞（LCI）

1. 对LCI Chamlide活细胞的仪器控制箱打开至少1小时前你要开始实验。控制箱还规定的国际狮子会Chamlide内的温度和湿度，调节流预混后的_5％CO 2。

注：这是明智的打开控制箱3小时实验开始前，以确保整个舞台达到34 ° C。这一步将减少焦点漂移，这是fluxulation和热膨胀的金属阶段引起的，因为它温暖，在成像。

2. 工作在流罩，喷Chamlide磁型文化室，镊子，用70％乙醇，并让他们干5分钟。
3. 从培养箱中取出细胞，并确认它们是健康的的。他们应该会出现贴壁，并与众多的膜过程玻璃盖玻片上的传播。强调转的细胞并不适合用于实验，将有一个过程扩展的数量减少，而且往往有一个不规则形的细胞核。
4. 6孔板倾斜，并取出镊子盖玻片。快速放置盖玻片细胞侧成文化室底板。不要让盖玻片干。
5. 将磁主要身体的文化室，并添加500μL媒体从原来的6孔盘到盖玻片上方。重新使用这种媒体将减少对环境变化所造成的细胞应力的量，也可以用于评估外分泌的因素。
6. 广场文化室的玻璃盖。
7. 使用KimWipe喷用70％乙醇，以去除任何残留物质从底部的盖玻片一个，这会干扰用显微镜。
8. 文化室放置在34 ° C / 5％ _二氧化碳培养箱中培养30分钟。这一步骤将确保分庭本身预热至34 ° C至减少盖玻片转移金属升温。

6。显微镜设置

图片在这里获得使用一个自定义的中继镜头和排放过滤器墨盒加载多个轮子的车轮罩（法定人数科技公司，G徕卡DMIRE2倒置显微镜uelph，ON）。

1. 明场 - 灯设置为2.5 V和240毫秒的曝光时间。
2. 在140红色荧光蛋白（RFP） - 增益设置为200毫秒。
3. 在140绿色荧光蛋白（GFP） - 增益设置为500毫秒。
4. 我们的显微镜调光灯控光对细胞的数量，而不是一个旋转的磁盘。我们光与运行我们的实验中，最大的灯强度的90％。

7。细胞治疗与细胞凋亡诱导剂和NucView 488 Caspase - 3的基板

1. 重要的是要提前准备凋亡诱导剂的大型股，并冻结他们在等分，使浓度将之间的实验一致。
2. NucView 488基板是光敏感。准备分装15μL，以减少冻结/解冻，并储存在-20 °铝箔覆盖的彗星管。用尽可能低的室温照明工作，以减少暴露的NucVIEW 488基板的光，在使用前。
3. 迅速从孵化器中检索的文化室，使细胞不暴露在温度降低。放置到显微镜的环境室文化室，并用夹具保持移动的文化室。在这一点上，你也应该昏暗的房间的灯。
4. 5％的CO ₂预混罐，打开双调节。
5. 使用10倍的目标，注重发现细胞在计算机上使用明场显微镜的监视器注意 ：你想使用所需的放大倍率客观上最大的数值孔径，以减少曝光时间。
6. 提供诱导细胞凋亡的细胞（在我们的案例80毫米钾，或100毫米谷氨酸），可以使用下列方法之一。我们将使用80毫米钾为例交付，使用作为一个典型的文化传媒的10倍浓缩溶解氯化钾。
   1. 媒体B股Ÿ慢和局部灌注：
      - 使用含80毫米钾的新媒体文化室交流媒体蠕动泵。
      - 管端将提供一个80毫米钾溶解在酚无DMEM的股票，1​​0毫升和油管的另一端，将删除从会议厅的媒体。
      - 你想媒体至少10倍的交流，以确保在会议厅内离开媒体正确的钾浓度。
      -交换媒体后，加3μLNucView 488基板，在会议厅内的媒体。吸管组合。
   2. 80毫米K ⁺和NucView 488基板媒体在文化室直接加入 ：
      - 准备了80毫米钾溶解在酚无DMEM 10倍原液。
      -加入3μLNucView 488基板50μL，10倍80毫米钾。吸管组合。添加500μL，苯酚的DMEM在文化室。
      注：此方法是首选，如果你有兴趣，在保持或评估增长或其他分泌的因素可能存在于原始媒体。我们发现，只要持续36小时的实验 NucView 488基板是在细胞培养稳定

8。活细胞成像

1. 点击显示转染细胞上的红色通道。
2. 选择并保存周围十几帧，那里有几个转染细胞，并保存这些“XY阶段分”。根据计算机的内存量，则可能是有限的阶段点的数量，你将能够获得。
3. 在这些保存的阶段有显微镜捕捉的图像（明场，红色通道和绿色通道）点每6分钟。
4. 任何绿色的染色，可见在实验的初期阶段，可能表明通常是由于细胞转染和/或环境压力，已经发生凋亡。 Apopt将在稍后时间点在实验中发现尘埃沉着病是由于实验治疗。

9。统计分析

1. 对于每一个实验中，我们计划在显微镜获得多重的XY点收集一套有效的大型数据。每个实验进行重复或一式三份，数据均来自独立的实验在不同的日子进行编译。我们从每个数据集，分析15视场和比较caspase阴性的细胞凋亡阳性细胞（细胞总数在实地查看/凋亡阳性细胞总数）的比例。

2. 从每一个数据集记录的测量组合成一个较大的样本集，然后另一个使用ANOVA表（P = 0.05）相比。我们显示平均每个实验的标准误差（SEM）的，然后比较在手段上的分歧，通过执行一个杜克手段的对比测试（P = 0.05），以确定WHICH治疗显著彼此不同。

10。代表性的成果

我们已经描述了一个实验来说明如何NucView 488基板可以显示N19 - OLG细胞培养细胞凋亡率增加，下面的治疗与高外钾离子浓度。 N19细胞转染与RFP，要么与3μL，NucView 488基板（控制），或3μLNucView 488基板和80毫米的治疗^[K +]（治疗） 。细胞进行了监测和图像均超过12 h时间当然，这是足够的研究涉及神经系统的侮辱（ 图1A）收购。在控制条件下，我们没有观察大量的细胞凋亡的80毫米相比^，[K +]对待文化（哈希盒），这表明约45％的细胞死亡后12小时（ 图 1B ）。背景绿色信号观察在控制条件下，d表示接受没有增加细胞外钾的细胞凋亡的细胞，。几乎没有控制实验展览由12 h时间点凋亡细胞，但在其他情况下的实验，可能需要运行的时间更长。获得10倍的目标。酒吧= 100微米。

图1。 （A）12小时的时间N19 OLG文化课程实验48 h后转染，表达RFP NucView 488基板（绿色通道）3μLMBP（红色通道） 。文化是可以治疗的终浓度为80毫米[K ^+]（左侧面板），或无治疗作为对照（右图）。图像获得6分钟的间隔，并显著裂解的caspase - 3激活（绿色信号）可观察（二）D在对待文化与80毫米[K ⁺在细胞核（哈希箱），比控制实验。裂解caspase - 3的细胞（细胞总数除以视野计算的百分比凋亡阳性细胞总数）。在控制条件相比，我们观察到约45％细胞死亡后，K ⁺处理12小时

SVIDEO 1一个12小时的时间N19 - OLG文化课程实验，48小时后转染表达RFP 3μLNucView 488基板（绿色通道）MBP（红色通道），与明场图像和三路沿合并后的形象，与80毫米以下的治疗[K ^+] 。

2。SVIDEO一个12小时的时间N19 - OLG文化课程实验48 h后转染表达与3μLNucView 488基板（绿色通道）RFP - MBP（红色通道），随着明场成像ES和三路合并后的图像。无治疗应用的文化和N19 - OLGs通过显微镜领域的迁移，可以看出在80毫米治疗的细胞培养^[K +]（比较SVIDEO 1）。

讨论

虽然这不是唯一的荧光产品可用于检测细胞凋亡，有几个显着的优势， 使用NucView 488基板。的主要好处之一是能够实时跟踪在活细胞的凋亡，而大多数的替代产品需要细胞裂解或细胞的通透性差。其他好处包括caspase - 3的识别，细胞的通透性高，低毒性，并与细胞凋亡的进展无干扰的高灵敏度。基板还具有低背景荧光，直到它被切割，进入细胞核，从而消除背景荧光。 caspase - 3的识别序列包含3负电荷的DNA结合的染料有一个正电荷。 DEVD - NucView 488分子，因而具有净负电荷，从而阻止细胞不活跃的caspase的活化和染料结合到DNA 。

马intaining实验之间的一致性是需要能够进行有意义的比较借鉴之间复制。保持一致的主要参数之一是细胞密度，因为它影响的转染率。获得高转染率在永生N19 OLG细胞培养超过其他常见的细胞株，如HeLa细胞或HEK293困难，是在我们的经验^{，12，13，}高度依赖于密度。我们对这些细胞的最佳转染效率都得到Fugene HD（罗氏），通常约15％，但可以达到30％以上，根据构造。仔细的细胞计数，将有助于取得一致的转染率。同样重要的是揭露，从不同的治疗环境压力相同程度的细胞，尤其是当测量凋亡率。具体来说，时间的长度，细胞暴露转染试剂，或光线照射量，是重要的环境变量ables考虑，并应保持在实验常数。对于我们的应用程序中，我们发现，搜集了大量的字段的视图提供一个足够大的样本大小，使统计显著比较[同上] 。

材料

试剂名称	公司	目录编号
NucView 488 Caspase - 3的活细胞检测试剂盒	Biotium公司	30029
FuGENE高清转染试剂	罗氏公司	04709705001
贝科的修改鹰中等	Gibco公司	31053-028
0.25％胰蛋白酶	Gibco公司	15050-065
胎牛血清	Gibco公司	12483-020
青霉素/链霉素	Gibco公司	15140122
＃1.5-25毫米玻璃盖玻片	华纳仪器	64-0715
Chamlide中巴磁 文化室为25毫米 盖玻片	法定人数技术	CM - B - 40
Cellstart组织文化10厘米的菜	VWR	82050-576
BD猎鹰6孔组织培养皿	VWR	CA62406 - 161