İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

Özet

Kaspaz 3 aracılı apopitoz ölümsüzleştirdi N19 oligodendrosit hücre kültürleri Canlı hücre görüntüleme kullanarak NucView 488 kaspaz-3 substrat. Bu teknik, çeşitli hücre tipleri ve dokular bir gerçek-zamanlı olarak programlanmış hücre ölümü testleri için geçerli.

Özet

Merkezi sinir sistemi, gerilmeler ve sonuçta nöronal nüfus ve işlev azalmasına neden sayısız olumsuz etkileri olabilir nörolojik hakaret, bir dizi deneyimi yaşayabilirsiniz. Hasarlı aksonlar da, astrositler ve oligodendrosit ^{8, 16} de dahil olmak üzere destekleyici glial hücreler daha fazla hakaret ve yaralanma üretebilir ekstraselüler matriks içine potasyum veya glutamat eksitatör moleküller de dahil olmak üzere serbest bırakabilirsiniz. Hakaret devam ederse, hücreler bir dizi köklü sinyal iletimi kaskadlar ¹⁴ tarafından düzenlenen ve aktif programlanmış hücre ölümü (apoptosis) tabi tutulacaktır. Apoptozis ve travmatik beyin yaralanması, serebral iskemi ve nöbet sonrası doku nekrozu oluşabilir. Apoptotik yönetmelik klasik bir örnek, bağımlı-sistein aspartat yönettiği proteazlar, veya caspases aile. Caspases dahil olmak üzere Aktive proteazlar da kronik nöro yanıt olarak hücre ölümüne suçlanmıştırAlzheimer, Huntington, Multipl Skleroz ^{4, 14, 3, 11, 7} gibi dejeneratif hastalıklar.

Bu protokolde, aşağıdaki gibi yüksek konsantrasyonlarda gibi farklı ekstrasellüler streslere maruz N19-oligodendrosit ölümsüzleştirdi (OLG) hücre kültürleri ^{15, 5} kaspaz-3 aracılı apoptoz hızını ölçmek için NucView 488 kaspaz-3 substrat kullanımını tanımlamak potasyum veya glutamat. Koşullu ölümsüzleştirdi N19 OLG hücre hattı (O2A progenitör temsil eden) Dr Anthony Campagnoni (UCLA Semel Nörobilim Enstitüsü) ^{15, 5} elde edilmiştir ve miyelin gen ekspresyonu ve önde gelen sinyal iletimi moleküler mekanizmaları incelemek için daha önce kullanılmakta olan farklılaşması (örneğin ^{6, 10)} OLG. Biz eksojen miyelin bazik protein (MBP) ile transfeksiyon saygı ile sağlam olması bu hücre hattı bulduk RFP veya GFP (kırmızı veya yeşil floresan protein) ^13, ya erimiş yapıları12. Burada, N19-OLG hücre ^{kültürleri,} 9 apopitoz indükleyen ekstraselüler matriks içine aksonal kaçak taklit 80 mM potasyum klorür ya da 100 mM sodyum glutamat ya ile tedavi edildi . Biz bir DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) kaspaz-3 tanıma alt birim ve DNA-bağlayıcı bir ^boya 2 içeren bir fırının kaspaz-3 substrat kullanılır . Substrat, hızlı bir şekilde hücre içi kaspaz-3 tarafından bölünmüş sitoplazma girer. Boya, NucView 488 serbest ve apoptozis sinyalizasyon, 488 nm dalga boyunda DNA ve fluoresces yeşil bağlar, hücre çekirdeğine girer . NucView 488 kaspaz-3 substrat kullanımı gerçek zamanlı ^{1, 10,} canlı hücre görüntüleme için izin verir. Bu video olarak, biz de ölümsüzleştirdi N19 OLG hücreler kültür ve transfeksiyon gibi canlı hücre görüntüleme teknikleri açıklanmaktadır.

Protokol

1. Çözülme ve Kültürleme Hücreleri

1. Uzun süreli sıvı azot mağazalardan donmuş ölümsüzleştirdi N19 oligodendroglial hücreleri stok alın.
2. 37 ° C su banyosuna daldırın flakon içeren hücreler, hücre süspansiyonu, tamamen çözülene kadar.
3. % 10 FBS (Fetal Bovine Serum) ve% 1 penisilin / 10 cm kültür plakasına streptomisin ile desteklenmiş yüksek-glukoz ile 7 mL DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta) ekleyin.
4. Hücre süspansiyon plaka açılan, bilge ve hafifçe ajitasyon ve hücreler eşit olarak dağıtmak için Petri plaka kaya ekleyin.
5. 34 ° C /% 5 CO ₂ inkübatör Kültür hücreler.
6. 4 saat sonra, dölveriminin olarak kullanılır olmuştu kalan DMSO (dimetil sulphoxide) kaldırmak ve taze medya (7 ml DMEM yüksek-glukoz medya% 10 FBS ile desteklenmiş ve% 1 penisilin / streptomisin) yerine plakaları aspirat medya .

2. Pasajlanması Hücreleri

1. % 70-80,izdiham (4-7 gün büyüme), medya hücreleri aspire.
2. Plaka için 1 ml% 0.25 tripsin ekleyin. Pipet tripsin hücreleri (yaklaşık 5 dakika) ayırmak için.
3. Deneysel koşullar ve geçişi için uygun dilüsyonları bir hücre yoğunluğu az olduğu için 0.1 x 10 ⁶ hücre / ml gelecek deneyler için ek bir 10 cm plaka olun.

Not: deneyler için onları kullanmadan önce çözülme sonra en az iki kez geçit hücreleri gerekir.

3. Hücreler Sayma ve Kaplama

1. Canlı hücre görüntüleme için plaka hücreleri için, daha önce açıklandığı gibi trypsinize.
2. Hücreleri yaklaşık 30 mcL çıkarın ve bir haemocytometer kullanarak saymak.
3. 6 plaka kaplamasız bir cam lamel yerleştirin. % 34 az 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ° C /% 5 CO ₂ ile desteklenen 0.1 x 10 ⁶ hücre / ml 2 ml fenol-DMEM yüksek glukoz medya yoğunluğu, iyi hücreleri ekleyin.
4. Izin vermek34 (16-20 saat) gece boyu büyümeye hücreleri ° C /% 5 CO ₂ transfeksiyon önce.

4. Transfeksiyon

1. 100 mcL serum özgür medya, plazmid DNA ve 4 mcL FuGENE HD (Roche) 0,5-4 mg saflaştırılmış birleştirin. Vortex yavaşça karıştırın.
2. Tekrar kısa bir süre vorteksleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DNA karmaşık ve daha sonra kültür hücreleri doğrudan FuGENE HD DNA karışımı ekleyin sağlar. Yavaşça karıştırın plaka yatırın.
3. 34 ° C /% 5 CO ₂ tedavi veya deney öncesinde ek bir 48 saat için Kültür hücreler.

5. Canlı Hücre Görüntüleme için hazırlık Hücreler (LCI)

1. LCI Chamlide canlı hücre aracı kontrol kutusu üzerinde deney başlamak istiyorum önce en az 1 saat açın. Kontrol kutusu da LCI Chamlide içinde sıcaklık ve nem düzenler ve önceden karıştırılmış% 5 CO ₂ akışını düzenler.

Not: Bu tavsiye edilirbaşlayan deneyler tüm aşamada 34 ° C ye ulaştığı sağlamak için önce 3 saat kadar kontrol kutusunu açmak Bu adım, görüntüleme sırasında, odak kayması, ısıtır gibi metal sahne fluxulation ve ısıl genleşme neden olduğu azaltacaktır.

2. Chamlide manyetik tip kültür odası, bir akış-luk Çalışma sprey ve cımbız,% 70 etanol ve 5 dakika kurumasını bekleyin.
3. Inkübatör hücreleri çıkarın ve sağlıklı olduğunu onaylayın. Onlar yapışık görünür ve çok sayıda membran süreçleri ile cam lamel iyi yayılır. Transfeksiyon gelen vurguladı hücreleri deney için uygun değildir ve süreç uzantıları sayısı azaltılmış olacak ve genellikle düzensiz şekilli bir çekirdek kadroya sahip.
4. 6 plaka Tilt ve cımbız ile lamel kaldırmak. Kültür odasının alt plaka hızla lamel hücrenin yan yerleştirin. Lamel kurumasına izin vermeyin.
5. Manyetik ana takınkültür odası beden ve orijinal 6-lamel üstüne plaka medya 500 mcL ekleyin. Yeniden kullanarak bu ortamın çevresel değişikliklere yol açtığı hücrelerin üzerine yerleştirilen stres miktarı azalacak, hem de ekstraselüler salgıladığı faktörleri değerlendirmek için yararlı olabilir.
6. Kültür odası cam kapak yerleştirin.
7. Mikroskobu ile müdahale lamel altındaki herhangi bir kalıntı malzemeyi kaldırmak için% 70 etanol ile püskürtülür KimWipe kullanın.
8. 34 kültür odası yerleştirin ° C /% 5 CO ₂ kuvöz, 30 dk . Bu adım, odanın kendisi 34 ısıtır emin ° metal ısınır C lamel değişen azaltmak için.

6. Mikroskop Ayarlar

Görüntüler özel bir röle lens ve kartuş yükleme için birden fazla tekerlekleri emisyon filtre salyangozunu (Çekirdek Technologies Inc, G Leica DMIRE2 inverted mikroskop kullanılarak elde edildiuelph, ON).

1. Aydınlık - Lamba 2,5 V ve pozlama 240 ms zaman ayarlayın.
2. Kırmızı Floresan Protein (RFP) - Kazancı 200 ms 140 olarak belirlenmiştir.
3. Yeşil Floresan Protein (GFP) - Kazanç 500 ms 140 olarak belirlenmiştir.
4. Mikroskop hücrelere ışık miktarını kontrol etmek için dönen bir disk yerine daha kısılabilir lambası vardır. Biz maksimum lamba yoğunluğu% 90 ile deneyler ışığında çalıştırın.

7. Apoptoz indükleyicileri ve NucView 488 Kaspaz-3 substrat Hücre Tedavisi

1. Konsantrasyonları deneyler arasında tutarlı olacak şekilde, vaktinden önce apoptozis indükleyicileri büyük stoklar alikotları olarak hazırlamak ve onları dondurmak için çok önemlidir.
2. NucView 488 yüzey ışığa duyarlı. -20 ° C alüminyum folyo kaplı dondurma / çözdürme ve mağaza tüpleri azaltmak için 15 mcL hacimde hazırlayın. NucV maruz kalmayı azaltmak için mümkün olduğunca düşük ortam aydınlatması ile çalışıniew 488 substrat kullanımı öncesinde, ışık.
3. Hücrelerin sıcaklığı azalmaya maruz böylece inkübatör hızla kültür odası al. Kültür odasının mikroskop çevre odasının üzerine yerleştirin ve hareket kültür odası tutmak için kelepçeler kullanmak. Bu noktada oda ışıkları loş da olmalıdır.
4. Çift regülatör ile% 5 önceden karıştırılmış CO ₂ tank açın.
5. 10x objektif kullanarak, parlak alan mikroskobu kullanarak bilgisayar monitörü hücreleri bulmak için odak Not: pozlama süresini azaltmak için istenen büyütme amacı, en büyük sayısal diyafram kullanmak isteyeyim.
6. Halinde 80 mM potasyum, ya da 100 mM glutamat) hücrelerinin (apoptozis indükleyici sunun, aşağıdaki yöntemlerden biri kullanılabilir. Biz tipik bir kültür ortamı 10x konsantre olarak çözünmüş KCl kullanılarak, örnek olarak 80 mM potasyum teslim kullanabilirsiniz.
   1. Media döviz by yavaş ve yerel perfüzyon:
      - 80 mM potasyum içeren yeni medya kültürü odasında değişim medya peristaltik bir pompa kullanın.
      - Hortumun bir ucu odasından medya kaldıracaktır 10 ml, 80 mM potasyum fenol-DMEM çözünmüş bir stok ve hortumun diğer ucunu sunacak.
      - Odanın sol medya potasyum konsantrasyonu doğru olduğundan emin olmak için medya en az 10x döviz istiyorum.
      Medya alışverişinde sonra, odasında medya NucView 488 substratın 3 mcL ekleyin. Karıştırmak için Pipet.
   2. Direkt olarak 80 mM K ⁺ ve NucView 488 kültür odasında medya substrat:
      - 80 mM potasyum fenol-DMEM çözünmüş 10x stok solüsyonu hazırlayın.
      - 50 mcL 10x 80 mM potasyum NucView 488 substratın 3 mcL ekleyin. Karıştırmak için Pipet. 500 mcL fenol-DMEM kültür odasında ekleyin.
      Not: Bu yöntemEğer büyüme ya da özgün ortam mevcut olabilecek diğer salgıladığı faktörleri korumak veya değerlendirilmesinde ilginizi çekiyorsa tercih etti. Biz NucView 488 Yüzey sürece 36 saat süren deneyler için hücre kültürü kararlı olduğunu bulduk

8. Live-hücreli Görüntüleme

1. Transfekte hücreler kırmızı kanal görüntülemek için tıklayın.
2. Seçin ve bir düzine kare etrafında birkaç transfekte hücreler vardır ve bu "XY noktaları" kaydedin. Bilgisayar belleği miktarına bağlı olarak, elde etmek mümkün olacaktır sahne puan sayısı sınırlı olabilir.
3. Bu kaydedilmiş aşamasında mikroskop yakalama görüntüleri (parlak alan, kırmızı kanalı ve yeşil kanal) var, her 6 dakikada bir işaret etmektedir.
4. Deneylerinin erken aşamalarında görünen herhangi bir yeşil boyama muhtemelen transfeksiyon ve / veya çevresel stres nedeniyle genellikle zaten apoptozis gören hücreler, gösterir. Apoptdeneysel tedaviler nedeniyle osis deney daha sonraki bir timepoint tespit edilecektir.

9 - İstatistiksel Analiz

1. Her bir deney için, verimli bir şekilde ayarlamak büyük bir veri toplamak için birden fazla XY puan elde etmek için mikroskop programı. Her deney yinelenen veya üç yapılır, ve veri, farklı günlerde yapılan ayrı deneyler derlenmiştir. Her bir veri kümesi, 15 alan görüş analiz ve kaspaz-pozitif hücrelerin (kaspaz-pozitif hücrelerinin toplam sayısı görünümü / alan hücrelerin toplam sayısı) kaspaz-negatif hücrelerin oranı karşılaştırmak.

2. Her veri seti kaydedilen ölçümleri daha büyük bir örneklem kümesi halinde gruplandırılmış ve sonra bir ANOVA tablosu (p = 0.05) kullanılarak başka bir ile karşılaştırıldığında. Biz her bir deney (SEM) ortalama standart hataları göstermek ve sonra wh belirlemek için Tukey karşılaştırma testi anlamına gelir (p = 0.05) yaparak anlamına gelir farkı karşılaştırmakich tedavileri birbirinden önemli ölçüde farklıdır.

10. Temsilcisi Sonuçlar

Biz NucView 488 substrat ekstrasellüler potasyum konsantrasyonu yüksek olan bir tedavi N19-OLG hücre kültürleri apoptozis oranında herhangi bir artış gösterir nasıl göstermek için bir deney tarif var. N19-hücreleri RFP ile transfekte ve ya 3 mcL NucView 488 substrat (kontrol), ya da 3 mcL NucView 488 substrat ve 80 mM ile tedavi edildi [K ^+] (tedavi). Hücreler monitorize edildi ve görüntüleri nörolojik hakaret (Şekil 1A) içeren çalışmalar için yeterli bir 12 saat zaman ders, üzerinden satın alındı. Kontrol koşullarında, 80 mM göre apopitoz önemli miktarda gözlemleyebilirsiniz vermedi [K ^+] 12 saat sonra (Şekil 1B) yaklaşık% 45 hücre ölümü gösterdi tedavi kültürleri (karma kutu). Arka plan yeşil sinyal gözlemlemekkontrol d ekstrasellüler potasyum ilavesi olmadan apoptozis gören hücreler gösterir. Diğer durumlarda deneyler uzun süre çalıştırmak için gerekli olabilir, ancak 12 saatlik bir zaman noktasında kontrol deneme sergi apopitoz hücrelerin hemen hemen hiçbiri. Görüntüler 10x objektif kullanılarak elde edildi. Bar = 100 mikron.

Şekil 1. (A) A N19 OLG kültürlerin 12 saat zaman elbette deney 48 saat sonrası transfeksiyon NucView 488 substrat (yeşil kanal) 3 mcL ile birlikte RFP-MBP (kırmızı kanal) ifade. Kültürler ya 80 mM nihai bir konsantrasyon ile tedavi edildi [K ^+] (sol panelleri), ya da bir kontrol (sağ panelleri) olarak hiçbir tedavi . Görüntüler 6 dakika aralıklarla satın alındı ​​ve önemli bölünmüş kaspaz-3 aktivasyonu (yeşil sinyal) gözlemlemek olabilirbölünmüş kaspaz-3 hücreleri (görüş alanında hücrelerin toplam sayısına bölünmesiyle hesaplanan d 80 mM tedavi kültürlerde [K ^+] kontrol deneyi ile karşılaştırıldığında hücre çekirdekleri (karma kutu) içinde (B) Yüzde kaspaz-pozitif hücrelerinin toplam sayısı). Koşulları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, K ⁺ tedavi 12 saat sonra yaklaşık% 45 hücre ölümü gözlenen

SVideo 1 N19-OLG kültürlerin bir 12 saat zaman elbette deney 48 saat aydınlık alan görüntüler ve üç yönlü bir NucView 488 substratın 3 mcL (yeşil kanal) ile birlikte, RFP-MBP (kırmızı kanal) ifade post-transfeksiyon Birleştirilen görüntünün, tedavi sonrası 80 mM [K ^+].

SVideo 2. N19-OLG kültürlerin bir 12 saat zaman ders deney 48 saat NucView 488 substratın 3 mcL (yeşil kanal) RFP-MBP (kırmızı kanal) ifade post-transfeksiyon, parlak alan imag ile birliktees ve üç yollu birleştirilen görüntü. Kültürlerin tedavi uygulandı ve 80 mM tedavi edilen hücre kültürleri aksine N19-OLGs mikroskop alanında aracılığıyla geçiş görülebilmektedir ^[K +] (1 svideo ile karşılaştırın) .

Tartışmalar

Bu apoptozis tespiti için mevcut tek EPA bir ürün olmamasına rağmen, NucView 488 substrat kullanarak birçok önemli avantajlar vardır . Önemli avantajlarından birisi de birçok alternatif ürünler ya hücre parçalama gerektiren veya hücre geçirgenliği zayıf iken, gerçek zamanlı olarak canlı hücrelerinde apoptozis takip yeteneği. Diğer faydaları kaspaz-3 tanıma, hücre geçirgenliği yüksek, düşük sitotoksisite ve apopitoz ilerlemesi ile hiçbir girişim için yüksek hassasiyet. Yüzey bölünmüş kadar düşük eşiğe ve eşiğe ortadan kaldıran çekirdeği girer. Kaspaz-3 tanıma sırası, 3 negatif yük içeren ve bir pozitif ^yük 2 DNA bağlayıcı boya vardır . DEVD NucView 488 molekül böylece kaspaz aktif değil hücrelerin DNA aktivasyonu ve boya bağlayıcı engelleyen bir net negatif yük vardır.

Annedeneyler arasında tutarlılık intaining çoğaltır arasında anlamlı karşılaştırmalar çizebilir gerekmektedir. Transfeksiyon oranını etkiler tutarlı tutmak için ana parametreleri biri, hücre yoğunluğu. Yüksek transfeksiyon oranları elde edilmesi ölümsüzleştirdi N19 OLG hücre kültürleri gibi HeLa veya HEK293 gibi diğer ortak hücre hatları ile daha zordur ve ^{tecrübemizi 12,} 13, yüksek yoğunluğuna bağlıdır . Bu hücreler için elimizden geleni transfeksiyon verimliliği Fugene HD (Roche) ile elde edilen ve normalde yaklaşık% 15, ancak inşa bağlı olarak,% 30 üzerinden ulaşabilirsiniz edilmiştir. Dikkatli hücre sayımı tutarlı transfeksiyon oranları elde edilmesinde yardımcı olacaktır. Apopitoz oranlarını ölçmek, özellikle çevresel stres aynı derecede farklı tedaviler hücreleri ortaya çıkarmak için de önemlidir. Özellikle, hücrelerin transfeksiyon reaktifler, ya da ışığa maruz kalma miktarı maruz üzerinde süresini önemli çevre değişkenables dikkate almak ve deneyler boyunca sabit kalmalıdır. Uygulamalar için, toplama alanları görünümü çok sayıda istatistiksel olarak anlamlı karşılaştırmalar yapmak için yeterince büyük bir örneklem büyüklüğü sağlar bulduk [age] .

Malzemeler

Reaktif Adı	Şirket	Katalog Numarası
Canlı Hücreler NucView 488 Kaspaz-3 Testi Kiti	Biotium	30029
FuGENE HD transfeksiyon reaktif	Roche	04709705001
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta	Gibco	31053-028
0.25% tripsin	Gibco	15050-065
Fetal sığır serumu	Gibco	12483-020
Penisilin / streptomisin	Gibco	15140122
# 1,5-25 mm cam lamel	Warner Aletleri	64-0715
Chamlide SPK manyetik 25 mm için kültür odası lamel	Çekirdek Teknolojileri	CM-B-40
Cellstart doku kültürü 10 cm yemekleri	VWR	82050-576
BD Falcon 6-iyi doku kültürü yemekleri	VWR	CA62406-161