三维细胞培养模式的测量肿瘤细胞浸润间质流体流动的影响

摘要

在实体肿瘤间质流体流动升高，可以调节肿瘤细胞的侵袭。在这里，我们描述了技术应用嵌入在一个矩阵的细胞间质流体流动，然后测量其细胞浸润的影响。这种技术可以很容易地适应学习其他系统。

摘要

大多数实体肿瘤的生长和发展依赖于初始变换的癌细胞，他们的反应基质的相关信号在肿瘤微环境^1。此前，在肿瘤微环境的研究主要集中在肿瘤基质的相互作用^1-2。然而，肿瘤微环境，还包括各种生物物理力量，其影响仍然知之甚少。这些部队是肿瘤生长的生物力学的后果，导致基因表达的变化，细胞分裂，分化和入侵^3。矩阵密度^4，5-6，刚度和结构^6-7，组织间液压力^8，8间质流体流动都改变在癌症的发展。

在肿瘤间质流体流动特别是高于正常组织^8-10。估计间质液FLOW速度进行了测量，发现是在0.1-3微米S ^-1的范围内，根据肿瘤大小和分化^9，11。这是由于肿瘤诱导的血管生成和血管通透性增加¹²所造成的升高间质流体压力。间质流体流动已被证明能增加入侵的癌细胞^13-14血管成纤维细胞和平滑肌细胞^15。这次入侵可能是由于自体细胞趋化细胞周围建立3 - D ^16的梯度或增加¹⁵基质金属蛋白酶（MMP）的表达，分泌趋化因子和细胞粘附分子表达^17。然而，细胞感受到流体流动的机制，不能很好地理解。此外，改变肿瘤细胞的行为，间质流体流动的调节其他细胞在肿瘤微环境的活动。它与（一）驾驶的成纤维细胞分化成肿瘤促进myofibr州^18，（B）抗原的搬运和其他可溶性因子，淋巴结肿大^19，（三）调节淋巴管内皮细胞形态^20。

这里介绍的技术对体外细胞间质流体流动和量化入侵（ 图1）的影响。这种方法已经公布在基质和癌细胞侵袭^{13日至15日，17}多个研究测量流体流量的影响。通过改变基质组成，细胞类型和细胞浓度，此方法可以适用于其他疾病和生理系统的研究侵袭，分化，增殖，基因表达，如细胞过程间流动的影响。

研究方案

1。含量的设置

1. 冰在4°C（约2小时），解冻的基底膜小等分（<500μL）。
2. 准备凝胶配方（看到表中的例子卷以下）：10倍PBS（总体积的1倍），1N钠氢（相当于0.023补充胶原蛋白的量，或每的胶原蛋白制造商的建议，如适用），基底膜和胶原键入我来终浓度为1毫克/毫升和1.3毫克/毫升（可用于其他基质配方，根据细胞类型和实验）。

例如凝胶配方

组件	股权集中度	终浓度	添加量
10X PBS	10X	1X	0.090毫升
无菌水			0.346毫升
1N氢氧化钠			0.008毫升
基底膜	9.90毫克/毫升	1毫克/毫升	0.101毫升
鼠尾I型胶原	3.66毫克/毫升	1.3毫克/毫升	0.355毫升

3. 上述孵育1小时的最终解决方案在同一顺序的混合冰凝胶的组成部分，在4°C根据我们的经验，1小时的孵化前更均匀的胶原凝胶细胞种植结果。确保在任何时候都保持冰基底膜和胶原工作，尽可能快，以防止凝胶。
4. 地方12毫米直径8微米孔细胞成12井板，用消毒镊子文化插入。
5. 在无血清培养基，在5×10 ⁶细胞/ ml（凝胶溶液总体积应该是10％），计数细胞，重悬。
6. 加入100μL细胞苏spension凝胶溶液900μL（最终细胞浓度5×10 ⁵细胞/ ml），调匀移液器轻轻上下。
7. 最后的混合物中加入150μL，每个插入和30分钟到37℃，5％ _二氧化碳培养箱，直到凝胶聚合。
8. 使用无血清培养基，

• 加入100μL插入静止状态下的凝胶和1200μL上。内插入和良好的外部流体的水平应该大致相等，从而导致整个凝胶，无间隙流的最小压差。
• 插入和650μL上述凝胶的水流条件下，加入100μL。要小心，以避免任何气泡下方的插入，因为他们将阻止细胞通过膜在这些地方迁移。这些卷所产生的压力差约1.3厘米高₂ O（或1毫米汞柱）。

9. 现浇板在37_{℃，5％CO2}培养箱24小时。

2。细胞染色和计数

1. 加入500μL的1X PBS，每到新的24孔板，这将被用来洗插入。
2. 取出介质留在的流动transwells的上部和确定音量。从最初的增加，650μL（这将用于流量计算，见下文）总量减去剩余量计算总的洗脱体积。用棉签从插入凝胶和擦拭膜的顶面，以消除非侵入细胞。 24 15秒以及含有1X PBS洗插入板放入插入。
3. 除去PBS和添加500μl4％多聚甲醛（PFA）的下孵育30分钟室温，修复transmigrated的细胞和每个插入的。
4. 删除的煤灰，用500μl1×PBS冲洗一次，以去除残留的固定液。
5. 加入500μLØf 0.5％的Triton X-100的解决方案下的插入和室温孵育10分钟通透细胞。
6. 切膜插入到2微克/毫升的DAPI 1X PBS溶液中加入100μl使用刀片和地方，小心地将膜朝下的底面（transmigrated细胞朝下）。
7. 保鲜膜板在铝箔上在室温为30分钟150转的振动筛的地方。
8. 在500μL1X PBS（重复3次，每次10分钟），以消除自由的DAPI对振动筛洗膜。
9. 广场膜transmigrated细胞朝上玻片上，加安装的解决方案和盖玻片。

3。数据分析

1. 依靠5随机选择每个膜的位置（远离边缘和使用10X或20X物镜）DAPI染色细胞核。
2. 使用下列公式计算平均细胞计数，并取得百分之入侵：
   入侵百分比= 100％×（平均细胞计数x膜面积）/（X号的显微图像细胞种子表面面积）
   ％的入侵可以归到一些控制条件（通常是静态的条件）允许独立的实验之间的比较。
3. 计算平均流速：孵化时间（如24小时），总分为洗脱体积流量条件。
4. 计算平均流速：凝胶/膜（在这种情况下，60毫米^2）截面积除以平均流速。

4。代表结果

以质流量下测量肿瘤细胞的侵袭，我们执行我们的3-D流使用的MDA-MB-435S转移性黑色素瘤细胞侵袭实验。先前已被证明这些细胞侵入间质流体流动^13-14。细胞包埋在1.3毫克/毫升大鼠大组成的矩阵升肌腱I型胶原和1毫克/毫升基底膜基底膜矩阵，最终细胞浓度在^5×10 5细胞/毫升。两个不同的条件进行了比较：（1）= 0.1微米^s-1和（2）静止状态=没有可测量的流量平均间隙流（ 图1）。

24小时后，用DAPI染色的膜，毛孔侵入细胞，通过促 ​​进细胞计数。 图2显示了一个入侵细胞的形象代表。根据明，只有膜孔是可见的。使用荧光，细胞核DAPI染色细胞计数和鬼笔环肽染色F-肌动蛋白的结构，用于可视化的细胞体（可选）。使用学生的t检验假设方差相等时，我们发现，间质性流量显着增加的MDA-MB-435S细胞浸润，由静态条件下的2.3倍（P = 0.003）（ 图3）。这corrobora工商业污水附加费类似的结果（但不同基质条件，因此流速），使用这种细胞线^13-14。

图1。的3-D间质流体流动的入侵检测的原理图。首先准备凝胶溶液使用适当的浓度和体积。再加入细胞凝胶溶液，并转移到细胞培养插入。最后加入适当体积的媒体每个条件和孵化。间质流体流动是由流体压头。

图2。Transmigrated膜的MDA-MB-435S细胞。入侵细胞被固定后，间质流体流动的入侵检测和染色DAPI和的Alexa Fluor 488标记的鬼笔，以方便侵入细胞的计数;图片的亮场下膜），B）的DAPI STA独立非执行董事的细胞核（蓝色），C）的Alexa Fluor 488-鬼笔环肽染色的F-肌动蛋白（绿色）。比例尺代表50微米。

图3。增加流量下的MDA-MB-435S细胞的入侵。 24小时后的细胞入侵质流（P = 0.003）显着提高。结果正常化平均静态条件下的值代表平均值±SEM 6细胞培养插入。

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讨论

在这里，我们所描述的量化对肿瘤细胞浸润间流动的影响，使用一个3-D矩阵嵌入细胞内的细胞培养插入方法。这和其他类似的方法已被用来研究多种细胞类型^{，13日至15日，17}间流动的影响。我们的做法，部分模仿使用类型的肿瘤基质微环境，我胶原和基底膜含有蛋白质发现在基底膜上皮组织和周围基质^21-22。这个系统是相对容易的设置了，简单，更具成本比大多数微流体装置，用?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
胶原蛋白（鼠尾）	屋宇署	354236	保持无菌
Millicell小细胞培养插入	Millipore公司	PI8P01250	8微米孔径，聚碳酸酯膜
基底膜	屋宇署	354234	保持无菌
PBS	Sigma Aldrich公司	100M-8202	10倍的准备凝胶溶液，1个洗涤步骤
氢氧化钠，1.0N解决方案	Sigma Aldrich公司	S2770	保持无菌
DMEM培养液1X	CellGro	10-013-CV	保持无菌
胎牛血清	亚特兰大生物	511150	保持无菌
青霉素链霉素	CellGro	30002CI	保持无菌
的Triton X-100	Sigma Aldrich公司	X100-500毫升	在PBS的0.5％
多聚甲醛	Fisher Scientific则	04042-500	4％的PBS
去离子水			保持无菌
4'，,6-diaminido-2-苯基吲哚（DAPI）	MP的Biomedicals	0215757401	1毫克/毫升原液
安装解决方案	Thermo Scientific的	TA-030调频
胰蛋白酶EDTA	CellGro	25-052-CI	保持无菌