תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

Summary

זרימת הנוזל ביניים הוא גבוה בגידולים מוצקים והוא יכול לווסת את הפלישה תאים סרטניים. כאן נתאר את הטכניקה ליישם זרימת הנוזל ביניים לתאים משוקע בתוך ולאחר מכן למדוד את השפעותיו על הפלישה התא. טכניקה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד מערכות אחרות.

Abstract

צמיחה והתקדמות של גידולים מוצקים רוב תלויים השינוי הראשוני של תאים סרטניים ואת תגובתם stroma הקשורים איתות microenvironment הגידול ^1. בעבר, מחקר על microenvironment הגידול התמקדו בעיקר גידולים סטרומה אינטראקציות ^1-2. עם זאת, microenvironment הגידול כולל גם מגוון של כוחות Biophysical, אשר תופעות להישאר ממעטים להבין. כוחות אלה הם תוצאות ביומכניים של הגידול להוביל שינויים בביטוי גנים, חלוקת התא, התמיינות ופלישה ^3. צפיפות מטריקס ^4, נוקשות ^5-6, והמבנה ^6-7, לחץ נוזלים ביניים ^8, ואת זרימת נוזל interstitial ⁸ משתנים במהלך כל התקדמות הסרטן.

זרימת הנוזל ביניים בפרט הוא גבוה יותר גידולים לעומת ^8-10 רקמות נורמליות. נוזל מוערך ביניים FLמהירויות ow נמדדו ונמצא כי בטווח של 0.1-3 מיקרומטר s ^-1, תלוי בגודל הגידול והבחנה ^{9, 11.} זאת בשל לחץ גבוה נוזל interstitial שנגרם על ידי הגידול אנגיוגנזה המושרית וחדירות כלי הדם מוגברת ^12. זרימת הנוזל ביניים הוכח להגדיל את הפלישה של תאים סרטניים ^13-14, fibroblasts כלי דם ותאי שריר חלק ^15. פלישה זו עשויה לנבוע הדרגתיים chemotactic עצמיים שנוצרו סביב תאים 3-D ¹⁶ או עלה metalloproteinase מטריקס (MMP) הביטוי ^15, הפרשת chemokine ו הידבקות התא מולקולות ביטוי ^17. עם זאת, המנגנון שבאמצעותו התאים לחוש זרימת הנוזל אינה מובנת היטב. בנוסף שינוי התנהגות תאים סרטניים, זרימת נוזל interstitial מודולציה את הפעילות של תאים אחרים microenvironment הגידול. היא מזוהה עם בידול (א) נהיגה של fibroblasts לתוך הגידול, קידום myofibroblasts ^18, (ב) ההובלה של אנטיגנים וגורמים מסיסים אחרים לבלוטות הלימפה ^19, (ג) הלימפה ויסות תא האנדותל המורפוגנזה ^20.

השיטה המוצגת כאן מטיל זרימת הנוזל ביניים על תאים במבחנה מכמת את השפעותיו על הפלישה (איור 1). שיטה זו פורסמו מחקרים רבים כדי למדוד את ההשפעות של זרימת הנוזל על סטרומה ופלישה סרטן תאים ^{13-15, 17.} על ידי שינוי הרכב מטריקס, סוג התא, וריכוז התא, שיטה זו ניתן להחיל על מחלות אחרות ומערכות פיזיולוגיות כדי לחקור את ההשפעות של זרם ביניים על תהליכים תאיים כגון התפשטות הפלישה, בידול, ועל ביטוי גנים.

Protocol

1. Assay Set-up

1. להפשיר aliquot קטן (<500 μl) של Matrigel על הקרח ב 4 ° C (כ 2 שעות).
2. להכין מתכון ג'ל (ראו כרכים לדוגמה בטבלה להלן): PBS 10x (1x בהיקף כולל), סודיום הידרוקסיד 1N (שווה ערך ל 0.023 כרכים של קולגן נוסף, או לפי המלצות היצרן של קולגן, על פי הצורך), הקלד Matrigel ו קולגן I ל הריכוזים האחרונים של 1 מ"ג / מ"ל ​​ו - 1.3 מ"ג / מ"ל ​​בהתאמה (ניסוחים מטריקס אחרים עשויים לשמש תלוי בסוג התא הניסוי).

ג'ל למשל המתכון

רכיבי	המניות ריכוז	ריכוז סופי	הוספת נפח
10X PBS	10X	1X	.090 מ"ל
מים סטריליים			.346 מ"ל
1N NaOH			.008 מ"ל
Matrigel	9.90 מ"ג / מ"ל	1 מ"ג / מ"ל	.101 מ"ל
זנב עכברוש סוג אני קולגן	3.66 מ"ג / מ"ל	1.3 מ"ג / מ"ל	.355 מ"ל

3. מערבבים את מרכיבי ג'ל על הקרח ברצף זהה מעל הפתרון הסופי דגירה של שעה 1 על 4 ° C. מניסיוננו, הדגירה 1 שעות לפני זריעת תוצאות תאים gelation אחיד יותר של קולגן. הקפד לשמור Matrigel ו קולגן על הקרח כל הזמן ולעבוד מהר ככל האפשר כדי למנוע gelation.
4. מקום 12 מ"מ בקוטר 8 מיקרומטר הנקבוביות סלולריים תרבות מכניס לתוך צלחת של 12 גם באמצעות מלקחיים מעוקרות.
5. ספירת תאים ו resuspend בסרום ללא מדיה ב 5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל (הנפח הכולל צריך להיות 10% של פתרון ג'ל).
6. הוסף 100 μl של תאים suspension ל μl 900 הפתרון ג'ל (ריכוז התאים הסופי 5 x 10 ⁵ תאים / מ"ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
7. הוסף 150 μl של התערובת הסופית כדי להוסיף כל העברה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור במשך 30 דקות עד ג'ל polymerizes.
8. שימוש בסרום ללא מדיה,

• הוסף 100 μl על גבי ג'ל ו 1200 μl תחת הכנס למצב הסטטי. רמות נוזל בתוך להוסיף ומחוצה היטב צריך להיות שווה בקירוב, וכתוצאה מכך ההבדל לחץ מינימלי על פני ג'ל ולא זרימת ביניים.
• הוסף 100 μl תחת הכנס ו 650 μl מעל ג'ל למצב את הזרימה. להיזהר כדי למנוע בועות אוויר מתחת הכנס, כפי שהם ימנעו תאים נודדים דרך הממברנה במקומות אלה. ההבדל הלחץ שנוצר על ידי כרכים אלה הוא כ 1.3 ס"מ H _{2 O} (או 1 מ"מ כספית).

9. במקום צלחת 37מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור במשך שעה 24.

2. תא מכתים והספירה נמשכת

1. הוסף 500 μl של 1X PBS לכל גם לתוך צלחת חדשה 24 טוב, זה ישמש כדי לשטוף את מוסיף.
2. הסר בינוני להישאר בחלק העליון של זרימת transwells ולקבוע את עוצמת הקול. חישוב נפח eluted הכולל על ידי הפחתת נפח הנותר מנפח הכולל הוסיף במקור, 650 μl (זה ישמש לחישוב שיעור הזרימה, ראה להלן). השתמש צמר גפן כדי להסיר את ג 'ל מ ו מוסיף את לנגב את המשטח העליון של קרום להסיר תאים שאינם שפלשו. מניחים את מכניסה לתוך צלחת 24-1X המכיל גם עבור PBS של 15 לשטוף מוסיף.
3. הסר PBS ולהוסיף 500 μl של paraformaldehyde 4% (PFA) מתחת להוסיף כל דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים transmigrated.
4. הסר את PFA ולשטוף פעם אחת עם 500 μl 1X PBS להסיר מקבע שיורית.
5. הוסף 500 μl Oו 0.5% טריטון X-100 הפתרון מתחת מוסיף ו דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי permeabilize התאים.
6. גזור ממברנות מתוך הכנס באמצעות סכין גילוח ומקום לתוך μl של 100 מיקרוגרם 2 / מ"ל ​​DAPI בפתרון PBS 1X, נזהר למקם את החלק התחתון של הפנים כלפי מטה קרום (תאים transmigrated עם הפנים כלפי מטה).
7. גלישת הצלחת בנייר אלומיניום ומניחים על שאכר בסל"ד 150 במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
8. לשטוף את הקרומים של 500 μl 1X PBS על שאכר (חוזר 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד) כדי להסיר DAPI חינם.
9. ממברנות מקום על שקופיות זכוכית עם תאים transmigrated פונה כלפי מעלה, להוסיף פתרון גוברת תלוש כיסוי.

3. ניתוח נתונים

1. ספירת DAPI מוכתם גרעינים על 5 מקומות שנבחרו באופן אקראי של קרום זה (להתרחק הקצוות ולהשתמש 10X או 20X עדשה אובייקטיבי).
2. לחשב את מספר הסלולרי הממוצע ולקבל את הפלישה אחוזים על ידי שימוש בנוסחה הבאה:
   הפלישה אחוזים = X 100% (תא הממוצע ספירת קרום x שטח הפנים) / (שטח הפנים של מספר התמונה X מיקרוסקופ של תאים seeded)
   הפלישה אחוזים ניתן מנורמל למצב שליטה מסוימת (בדרך כלל מצב סטטי), כדי לאפשר השוואה בין ניסויים בלתי תלויים.
3. לחשב את שיעור הזרימה הממוצע: לחלק את נפח eluted סך במצב זרימת עד הדגירה (למשל 24 שעות).
4. חשב את מהירות זרימת ממוצע: לחלק את קצב הזרימה הממוצע של שטח חתך של ג'ל / קרום (במקרה זה 60 מ"מ ^2).

4. נציג תוצאות

כדי למדוד את הפלישה תאים סרטניים תחת זרם ביניים, ביצענו 3-D שלנו הפלישה זרימת assay באמצעות מד"א-MB-435S בתאי מלנומה גרורתית. תאים אלה בעבר הוכח לפלוש בתגובה זרימת הנוזל ביניים ^13-14. התאים היו מוטבע מטריצה ​​מורכבת של 1.3 מ"ג / מ"ל ​​עכברוש טאיקולגן אני הגיד סוג I ו 1 מ"ג / מ"ל קרום Matrigel מטריקס במרתף בריכוז התא הסופי של 5 x 10 ⁵ תאים למ"ל. שני תנאים שונים הושוו: (1) זרימת ביניים הממוצע = 0.1 מיקרומטר של ^-1 ו - (2) מצב סטטי = לא הספיקה מדידה (איור 1).

אחרי 24 שעות, התאים שפלשו דרך הנקבוביות של קרום הוכתמו DAPI כדי להקל על ספירת התאים. תרשים 2 מציג תמונה מייצגת של תאים שפלשו. תחת brightfield, רק את נקבוביות הממברנה גלויים. באמצעות הקרינה, גרעינים DAPI מוכתם שימשו ספירת התאים את phalloidin F-אקטין מבנים מוכתמים שימשו לדמיין גוף התא (לא חובה). באמצעות הסטודנטים של מבחן t בהנחה שונויות שוות, אנו הראו כי זרימת ביניים מגביר באופן משמעותי את מד"א-MB-435S הפלישה התא על ידי 2.3 על פי התנאים סטטיים (p = 0.003) (איור 3). זה בשיתוף פעולה נרחבTES ממצאים דומים (אך עם תנאים שונים מטריקס ולכן מהירויות הזרימה) באמצעות את שורות התאים ^13-14.

באיור 1. סכמטי של 3-D זרימת נוזל interstitial assay הפלישה. ראשית להכין פתרון ג'ל באמצעות ריכוזים מתאימים ואמצעי אחסון. לאחר מכן להוסיף תאים לפתרון ג'ל ולהעביר מוסיף תרבית תאים. לבסוף להוסיף נפח מתאים של התקשורת למצב כל דגירה. זרימת הנוזל ביניים הוא מונע על ידי ראש לחץ נוזלים.

איור 2. Transmigrated מד"א-MB-435S על קרום התאים. תאים שפלשו נקבעו לאחר assay זרימת ביניים שלנו הפלישה נוזל ומוכתמים DAPI ו-Alexa פלואוריד 488 מצומדות phalloidin כדי להקל על ספירת התאים פלשו; תמונה) של קרום מתחת לשדה בהיר, ב ') DAPI STAגרעינים עומד לבחינה (בכחול); C) Alexa פלואוריד 488-phalloidin צבעונית F-אקטין (בירוק). סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר.

איור 3. הגדלת הפלישה של מד"א-MB-435S תאים תחת הזרם. הפלישה התא לאחר 24 שעות משופרת באופן משמעותי על ידי זרימת ביניים (p = 0.003). התוצאות מנורמל למצב סטטי הממוצע וערכים מייצגים ממוצע ± SEM של 6 מוסיף תרבית תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן אנו מתארים מתודולוגיה לכימות ההשפעה של זרימת ביניים על הפלישה תאים סרטניים, תוך שימוש בתאי משוקע בתוך 3-D בתוך להוסיף תרבית תאים. שיטות אלה דומים שימשו כדי ללמוד את ההשפעה של זרימת ביניים על מגוון רחב של סוגי תאים ^{13-15, 17.} הגישה שלנו מחקה באופן חלקי microenvironment מטר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
קולגן (זנב עכבר)	BD	354236	שמור סטרילית
תרבות Millicell תא הוספה	Millipore	PI8P01250	8 נקבוביות בקוטר מיקרומטר, פוליקרבונט הממברנה
Matrigel	BD	354234	שמור סטרילית
PBS	סיגמא אולדריץ'	100-8202	10x להכנת הפתרון ג'ל, 1x לשטיפת צעדים
נתרן הידרוקסידי, פתרון 1.0N	סיגמא אולדריץ'	S2770	שמור סטרילית
DMEM 1X	CellGro	10-013-CV	שמור סטרילית
בסרום שור עוברית	אטלנטה ביולוגיות	511150	שמור סטרילית
פניצילין סטרפטומיצין	CellGro	30002CI	שמור סטרילית
טריטון X-100	סיגמא אולדריץ'	100 x-500 מ"ל	0.5% ב PBS
Paraformaldehyde	פישר סיינטיפיק	04042-500	4% ב PBS
Deionized מים			שמור סטרילית
4 ',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI)	מגה פיקסל Biomedicals	0215757401	1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות
הרכבה פתרון	Thermo Scientific	מדד ת"א 030-FM
טריפסין-EDTA	CellGro	25-052-CI	שמור סטרילית