饲养和注射<em&gt;烟草天蛾</em&gt;幼虫评估细菌的毒力

摘要

这里所描述的方法采用直接注射昆虫病原细菌进入血淋巴烟草天蛾昆虫的幼虫。 M.天蛾

摘要

烟草天蛾 ，俗称烟草天蛾，被认为是一种重要的农业害虫，取食茄科植物，包括烟草和番茄。的敏感性M.烟草天蛾幼虫，各种昆虫病原细菌物种^1-5，以及丰富的信息提供有关昆虫的免疫系统^6-8，悬而未决的基因组序列⁹它一个很好的模式生物用于研究宿主-微生物相互作用在发病机制。此外，M.烟草天蛾幼虫是比较大，且易于操作，并在实验室中保持相对于其他易感昆虫物种。他们的大尺寸也有利于有效的组织/血淋巴的提取分析宿主对感染的反应。

这里介绍的方法描述了直接注射的细菌进入血淋巴（血腔） 的影响烟草天蛾幼虫。这种方法可以使用各种细菌菌种，菌株，或突变体，通过简单地监测昆虫死亡的时间注射后的毒力特性进行分析和比较。这种方法的开发研究的致病性嗜和 Photorhabdus物种，通常与线虫载体为手段，以获得进入昆虫的。通常感染昆虫病原线虫幼虫通过自然的消化系统和呼吸系统的开口，并释放它们的共生细菌进入昆虫血淋巴（血），此后不久^，10。这里描述的注射方法绕过需要为线虫矢量，从而脱开细菌和线虫的效果上的昆虫。此方法允许精确枚举传染性物质（细胞或蛋白质）内的接种物，这是不可能使用其他的现有的方法，用于分析entomopathogenesis，包括刻痕¹¹和经口毒性实验¹² 这里所描述的直接注射法的效用是，分析细菌致病通过监测昆虫死亡率。然而，该方法可以很容易地被扩展用于分枝杆菌感染的影响研究天蛾免疫系统。这种昆虫感染的反应通过体液免疫和细胞反应。的体液应答包括确认细菌相关的模式和各种抗微生物肽的后续生产⁷编码这些肽的基因的表达，可以监测直接感染后，通过RNA的提取和定量PCR ^13。涉及瘤细胞对感染的反应，封装和血细胞吞噬作用的传染性病原体的⁶ 13日，14。

研究方案

1。昆虫卵的消毒和饲养

1. 准备由第一高压灭菌15克所提供的琼脂的饮食在900-1,000毫升H _{2 O。}立即高压灭菌后，拌入166克小麦胚芽饮食和融合，以及在实验室搅拌器。倒入一盘菜（菜）冷却，然后将其转移到铝箔的饮食，包裹得紧紧的，储存于4°C。
2. 抵达后，消毒M.天蛾鸡蛋与250毫升0.6％的漂白剂溶液的玻璃过滤器托架和真空烧瓶装置用一个90毫米的滤纸，偶尔搅拌2-3分钟。
3. 打开真空漏极与250毫升无菌蒸馏H _{2 O}每洗涤漂白剂溶液和洗涤鸡蛋3-4倍。
4. 将鸡蛋新鲜90 mm的滤纸放在一个培养皿盖子，并允许他们干，直到他们不再粘在一起（约20-30分钟）。
5. 塑料容器的底部与传送鸡蛋昆虫饮食，在每个容器中放置约40蛋（ 图1A）。鸡蛋分开饮食，以防止水分引起的真菌污染。保持在26°C的鸡蛋，一个16小时光照：8小时黑暗的光照。鸡蛋会减轻到黄白色，孵化前的。
6. 当孵化完成后，仔细约25幼虫转移到新的容器与饮食的底部（ 图1B）。重要的是要拿起黑色的长角，使用产钳，以避免伤害他们，在他们​​脆弱的早期发育阶段的每个幼虫。孵育2天作为以上。虽然在这个阶段，幼虫死亡是不寻常的一些死，或者更可能的是，幼虫发育发育不良。这种昆虫应该被排除在进一步的研究和牺牲冻结。
7. 为了避免吃人的行为，转移幼虫到单独的容器中，用小块的食物（ 图1C）和孵化如上。监测昆虫生长发育，更换食物和清洁的粪便欧t的容器每隔一天，直到他们接受第三幼虫蜕皮（通常为6-9天孵化后）。这是^第 4龄幼虫期，其特征在于，在每个的前脚和增加突出的条纹沿昆虫体（ 图1D）的外观黑色钩状crochets的。幼虫的大小有很大的不同，但0.15-0.4克的重量通常在进入4 ^龄阶段。幼虫的类似大小应选择用于注射。

2。制备注射液的细菌

1. 成长的细菌菌株（S）的增长阶段，你想测试的标准程序进行测试。
2. 通过纺丝，在室温下以13,000 rpm离心2分钟，在要测试的粒料500μl的每个菌株。
3. 悬浮细胞在1毫升无菌1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）和颗粒再次如上。
4. 悬浮细胞在0.5毫升无菌1×PBS和测量确定光学密度（OD）的悬浮液。稀释所有的悬浮液，以同样的OD，如果必要的话。细胞再悬浮和代替的1x PBS稀释无菌生长培养基也可能被用于，如果需要的话。

3。注射^第 4龄幼虫

1. 准备串行的10倍稀释液的第一菌株在6个孔的96孔微量滴定板在无菌的1×PBS中，使用新鲜的移液管尖，每个稀释度（ 图2A）。各孔中的细胞悬浮液的最终体积应超过所需体积的注射（10微升按每昆虫）加20微升板的接种物（见步骤3.2和3.7）。
2. 现货各10微升含有适当的生长培养基中的Petri板沿顶部5稀释液（10 ^-2至10 ^-6）。倾斜板，使斑点分布的中心（ 图2B）。
3. 在容器中删除昆虫的饮食，粪便和地方的昆虫冰约5分钟。
4. 消毒的注射器针头，通过漂洗3次，每次2管的70-100％乙醇中，然后由一个管的无菌，H _{2 O的} （ 图2C）。的液体的体积必须是足以淹没针。
5. 定量稀释细胞悬浮液，在显微镜下，使用血细胞计数器。根据所需的接种物，得出10微升从适当的微量滴定孔（ 图2D）。
6. 棉签昆虫表面用95％乙醇，并注入10毫升细胞悬浮液中，以一个角度（小于45°）进入昆虫背后的一个腹部前腿。请注意，不要穿刺肠道注入的的内容正下方的表皮细胞层（ 图2E）。虽然有些损失是正常的血淋巴（清晰，绿色 - 蓝色的液体），颗粒物和黄色液体从注射部位出现表明肠道穿刺。如果发生这种情况，牺牲的昆虫，并重新获得一个新的幼虫把它。
7. 在第一次注射组，对其余每个昆虫，重复步骤3.6。针灭菌注射相同的稀释和细菌菌株的每个昆虫，除非发生污染之间是没有必要的。或者，可以使用的重复分配器在样品注射体积之间的更大的一致性。
8. 注入每个昆虫与第一应变的细菌后，重复步骤3.2，这一次发现的细胞悬浮液在板的中间，并让他们朝下方流动（ 图2F）。孵育板在适当的温度和算殖民地枚举接种。该第二电镀工序是用来验证样品在注射过程中不被污染，因为这会导致完全不同的集落数之间的第一和第二镀层。
9. 重复步骤3.1至3.8，在实验中对每种菌株的细菌。最后，注入3-5昆虫不育1X PBS使用STER异亮针作为阴性对照组。在26°C温育昆虫，一个16小时光照：8小时黑暗的光照。
10. 随着时间的推移，注射后监测昆虫的生存。昆虫死亡的特点是刺激后，由于缺乏自主性运动。昆虫往往表现出食欲不振，腹泻（水样便，黄色的粪便），和/或水的损失（“出汗”）在感染过程中死亡前，这些特征可能是值得一提的还有。

结果

是图3中所示的昆虫死亡率测定的代表性示例。在这个实验中，与约50菌落形成单位（CFU）的野生型（ATCC19061）或减毒的突变株（LRP ^13）， 嗜线虫致病杆菌的生长中期日志相组（n = 6昆虫每株）昆虫注射。昆虫观察到约72小时，和记录在每个时间点％注入昆虫还活着。在这种情况下，弱毒株呈明显的延迟杀虫，野生型菌株注射后30小时内杀死了所有6幼虫之前，任何?...

讨论

直接注入M.烟草天蛾幼虫与昆虫病原细菌，如这里描述的，作为一个简单的和有效的手段来分析细菌的毒力。的方法，还具有很高的适应性，以适应不同的实验对象和/或条件。细菌可以在注射之前，以各种方式来制备。在X的箱子线虫 ，野生型细胞生长在营养丰富的Luria-Bertani（LB）培养基中对数期通常是最致命的，注射后30小时内杀死了大部分或所有的昆虫。固定相的细胞通常...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂	公司	目录编号	评论
90毫米滤纸	Whatman公司	1001 090
玻璃过滤器支架	密理博	XX1004700
烟草天蛾鸡蛋	卡罗来纳州生物供应	143880
舞毒蛾饮食+琼脂	MP Biomedicals	0296029301
5.5盎司塑料容器和盖子	个杯公司	URC55-0090 PL4-0090
1盎司塑料容器和盖子	DART集装箱公司	100PC 100PCL25
1X PBS			137毫米的NaCl，2.7 mM KCl中，8毫摩尔的Na 2 HPO 4，1.46毫摩尔KH 2 PO 4，pH为7.4
注射器	汉密尔顿	80208	30号，0.375“长，点式2