גידול והזרקה של<em&gt; Manduca סקסטה</em&gt; זחלים להערכה ארסית קטריאלי

Summary

השיטה המתוארת כאן מנצלת הזרקה ישירה של חיידקי entomopathogenic לhemocoel של Manduca סקסטה זחלי חרקים. מ סקסטה הוא חרק זמין מסחרי ונחקר היטב. לכן, שיטה זו מייצגת גישה פשוטה לניתוח אינטראקציות מארח בקטריאלי מנקודת המבט של אחד או שני בני הזוג.

Abstract

Manduca סקסטה, הידוע בכינויו hornworm הטבק, נחשבת למזיק חקלאי משמעותי, האכלה על צמחי solanaceous כוללים טבק ועגבנייה. רגישותו של מ ' זחלי סקסטה למגוון מיני entomopathogenic חיידקי ^1-5, כמו גם השפע של מידע הזמין לגבי מערכת חיסון של חרק ^6-8, ואת רצף הגנום עד ⁹ להפוך אותו לאורגניזם מודל טוב לשימוש בחקר אינטראקציות מארח חיידק במהלך פתוגנזה. בנוסף, מ ' זחלי סקסטה גדולים יחסית וקלים לתפעל ולתחזק במעבדה היחסית למיני חרקים רגישים אחרים. ממדיהן גדולים גם מאפשרים מיצוי רקמה / hemolymph יעיל לניתוח של תגובת המארח לזיהום.

השיטה שהוצגה כאן מתארת ​​הזרקה הישירה של חיידקים לhemocoel (חלל דם) של מ ' זחלי סקסטה. גישה זוניתן להשתמש בו כדי לנתח ולהשוות את המאפיינים הארסיים של מינים שונים של חיידקים, נקע, או פשוט על ידי מוטציות ניטור הזמן למות חרק לאחר הזרקה. שיטה זו פותחה ללמוד פתוגניות של Xenorhabdus ומיני Photorhabdus, אשר בדרך כלל לקשר עם וקטורים נמטודות כאמצעי לזכות כניסה לחרקים. נמטודות Entomopathogenic בדרך כלל להדביק זחלים דרך עיכול טבעי או פתחי נשימה, ולשחרר את תוכנם לתוך החיידקים סימביוטיים hemolymph החרקים (דם) זמן קצר לאחר מכן ^10. שיטת ההזרקה המתוארת כאן עוקפת את הצורך בוקטור נמטודות, ובכך מתירה את ההשפעות של חיידקים ונמטודות על החרקים. שיטה זו מאפשרת לספירה מדויקת של חומר מדבק (תאים או חלבונים) בבידוד, דבר שאינו אפשרי בשיטות קיימות אחרות לניתוח entomopathogenesis, כוללות לסחוב ¹¹ ומבחני רעילות אוראליים ¹² התועלת של שיטת ההזרקה הישירה כפי שתואר כאן היא לנתח פתוגנזה חיידקים על ידי ניטור תמותת חרקים. עם זאת, שיטה זו יכולה בקלות להיות מורחבת לשימוש בחקר ההשפעות של זיהום על מ ' מערכת חיסונית של סקסטה. החרקים מגיבים לזיהום באמצעות שתי תגובות הומורלית ותאיות. התגובה הומורלית כוללת זיהוי תבניות חיידקים הקשורים והפקה הבאה של פפטידים שונים מיקרוביאלית ^7; הביטוי של גני מקודדי חלבונים אלה יכול להיות במעקב לאחר זיהום ישיר באמצעות RNA חילוץ וכמותית PCR ^13. התגובה התאית לזיהום כרוך nodulation, אנקפסולציה, וphagocytosis של חומרים מזהמים על ידי hemocytes ⁶ 13, 14.

Protocol

1. עיקור ביצת חרקים וגידול

1. הכן את הדיאטה של 15 גרם מעוקר הראשון של אגר ספק ב900-1,000 המ"ל H ₂ O. מייד לאחר מעוקר, לערבב עם דיאטה 166 גר 'ניבט חיטה ותערובת היטב במעבדת בלנדר. יוצק לצלחת (או צלחות) להתקרר, ואז להעביר לדיאטת רדיד אלומיניום, עוטף היטב, ולאחסן ב 4 ° C.
2. עם הגעתו, לעקר מ ' ביצי סקסטה עם 250 מ"ל של 0.6% בתמיסת כלור ל2-3 דקות בבעל זכוכית מסנן ומכשירים ירמסו עם נייר סינון 90 מ"מ, תוך ערבוב מדי פעם.
3. הפעל ואקום לניקוז תמיסת כלור וביצי 3-4 פעמים לשטוף עם 250 המ"ל סטרילי המזוקק H ₂ O לשטיפה.
4. העברת ביצים לנייר חדש 90 מ"מ מסנן להציב מכסה צלחת הפטר ולאפשר להם להתייבש עד שהם כבר לא ביחד מקל (כ 20-30 דקות).
5. העברת ביצים לתחתית מכלי פלסטיק עם דיאטת חרקים, צבת כ 40 ביצים בכל מכולה(איור 1 א). ביצים מופרדות מדיאטה על מנת למנוע זיהום פטרייתי לחות מושרה. לשמור על ביצים על 26 ° C עם אור 16 שעות: 8 השעות photoperiod הכהה. ביצים תהיינה להאיר לצבע צהוב לבן לפני הבקיעה.
6. כאשר הבקיעה היא מוחלטת, להעביר בזהירות כ 25 זחלים לכל מכולות חדשות עם דיאטה בתחתית (1B איור). חשוב לאסוף את כל זחל על ידי הקרן השחורה הארוכה באמצעות מלקחיים, כדי למנוע פגיעה בם במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים השבירים שלהם. דגירה עבור 2 ימים כאמורים לעיל. בעוד מות זחל הוא יוצא דופן בשלב זה, חלק הזחלים מתים או, סבירים יותר, ננסי התפתחותית אפשר לראות. חרקים כאלה צריכים להיות מחוץ למחקר נוסף והקריבו על ידי הקפאה.
7. כדי להימנע מהתנהגויות קניבליות, זחלי העברה למכלים נפרדים עם חתיכות קטנות של אוכל (התרשים 1C) ודגירה כאמורה לעיל. לעקוב אחר התפתחות חרקים, צואת החלפת מזון וניקוי ouלא של מכולות בכל יום אחר עד שהם עוברים את נשירת הזחל השלישית (בדרך כלל 6-9 ימים לאחר בקיעה). זה שלב ^ה 4 instar הזחל, המתאפיין במראה של crochets קרס השחור על כל גדולת proleg ומוגברת של פסים לאורך גוף החרק (1D איור). הזחלים עשויים להשתנות במידה ניכרת בגודלה, אך בדרך כלל שוקלים 0.15-0.4 גרם עם כניסתו לבמת instar ^-4. זחלים בגודל דומה צריכים להיבחר להזרקה.

2. הכנה של חיידקים להזרקה

1. לגדול זן החיידקים (הים) להיבדק על פי נהלים הרגילים לשלב הצמיחה ברצונך לבדוק.
2. 500 μl הגלולה של כל זן חיידקים שנבדק על ידי ספינינג עבור 2 דקות בmicrocentrifuge ב13000 סל"ד בטמפרטורת חדר.
3. תאי resuspend בפוספט 1x סטרילי 1 המ"ל נאגרו מלוחים (PBS) וגלולה שוב כאמור לעיל.
4. תאי resuspend ב 0.5 המ"ל סטרילי 1x PBS וmeaבטוח הצפיפות האופטית (OD) של ההשעיה. לדלל את כל ההשעיות לאותו OD, במידת צורך. תקשורת צמיחה סטריליים עשויה לשמש גם לresuspension תא ודילול במקום 1x PBS, אם תרצה בכך.

3. הזרקה של 4 זחלי Instar ^ה

1. הכן דילולים סידוריים 10-קיפול של זן החיידקים הראשון ב6 בארות של צלחת 96-microtiter גם ב1x PBS סטרילי, באמצעות קצה פיפטה טריה עבור כל דילול (איור 2 א). הנפח הסופי של השעית תא בכל אחד גם צריך לחרוג הנפח נדרש להזרקה (10 μl לחרקים) בתוספת 20 μl לצלחת הבידוד (ראה שלבים 3.2 ו -3.7).
2. 10 μl ספוט כל במשך 5 דילולים ^-2 (10 עד 10 ^-6) בחלק העליון של צלחת פטרי המכיל מדיום גידול מתאים. הטה את הצלחת כך שהכתמים התפשטו למרכז (איור 2 ב ').
3. הסר דיאטת חרקים וצואה וחרקי מקום במכולות על קרחכ 5 דקות.
4. לעקר את מחט המזרק על ידי שטיפת 3 פעמים כל אחד ב 2 צינורות של אתנול 70-100%, ואחריו צינור אחד H ₂ O סטרילי (האיור 2C). הנפח נוזלי חייב להיות מספיק כדי להטביע את המחט.
5. לכמת את המתלים הסלולריים לדלל תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer. בהתאם לבידוד הרצוי, לצייר 10 μl מmicrotiter המתאים היטב (האיור 2D).
6. ספוגית משטח החרקים עם אתנול 95%, ולהזריק את השעית תא 10 מ"ל לחרקים בזווית (פחות מ 45 מעלות) מאחורי אחד מprolegs הבטן. יש להיזהר שלא לנקב את המעי ולהזריק את התוכן בדיוק מתחת לשכבת האפידרמיס (2E איור). בעוד שחלק אובדן hemolymph (נוזל שקוף, ירוק כחול) הוא נורמלי, חומר חלקיקים ונוזל צהוב יוצא מאתר ההזרקה מעיד על לנקב מעי. במקרה זה, להקריב את החרק ולהשיג זחל חדש מחדשלמקם אותו.
7. חזור על שלב 3.6 לכל חרק שנותר בקבוצת הזריקה הראשונה. מחט העיקור אינו הכרחי בין כל חרקים הזריקו עם אותו הדילול והזן של חיידק אלא אם זיהום מתרחש. לחלופין, מנפק חוזר עשוי לשמש לעקביות רבה יותר בנפח הזרקה בין דגימות.
8. לאחר ההזרקה כל חרקים במתח הראשון של חיידקים, חזור על שלב 3.2, הפעם ייכון השעיות סלולריות באמצע הצלחת ולתת להם לזרום לכיוון החלק התחתון (האיור 2F). דגירת צלחות בטמפרטורה המתאימה ולסמוך מושבות למנות בידוד. צעד 2 ציפוי זה משמש כדי לוודא שהדגימות אינן מזוהמות במהלך תהליך ההזרקה, שכן דבר יגרום למספרי מושבה שונים בין platings הראשון והשני.
9. חזור על שלבים 3.1 עד 3.8 לכל זן של חיידק בניסוי. לבסוף, להזריק 3-5 חרקים עם 1x PBS סטרילי באמצעות sterמחט איל כקבוצת ביקורת שלילית. דגירת חרקים ב 26 ° C עם אור 16 שעות: 8 השעות photoperiod הכהה.
10. פקח על הישרדות חרקים לאורך זמן לאחר הזרקה. מות חרק מאופיין כחוסר תנועה רצונית על גירוי. חרקים מציגים לעתים אובדן תיאבון, שלשולים (צואה מימית, צהובה), ו / או אובדן מים ("זעה") במהלך זיהום לפני המוות; מאפיינים אלו עשויים להיות ראויים לציון גם כן.

תוצאות

דוגמה מייצגת של assay תמותת חרקים מתואר באיור 3. בניסוי זה, חרקים הוזרקו כ 50 יחידות להרכיב מושבה (CFU) של כל אחד מסוגים פרא (ATCC19061) או זן מוחלש מוטציה (LRP ¹³⁾ של Xenorhabdus nematophila גדל שלב יומן האמצע (n = 6 חרקים למתח). חרקים נצפו במשך כ 72 שעות, ואחוזים מהחרקים הזר...

Discussion

ההזרקה הישירה של מ ' זחלי סקסטה עם חיידקי entomopathogenic, כפי שמתוארים כאן, משמשים כאמצעי פשוט ויעיל לניתוח ארסיות חיידקים. השיטה היא גם ישימה מאוד כדי להתאים לנושאים ניסיוניים שונים ו / או תנאים. חיידקים יכולים להיות מוכנים בדרכים קודמות להזרקה שונות. במקרה של

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
90 נייר סינון מ"מ	Whatman	1001 090
בעל זכוכית מסנן	Millipore	XX1004700
Manduca סקסטה ביצים	אספקת קרוליינה הביולוגית	143880
דיאט עש הצועני + אגר	Biomedicals MP	0296029301
5.5 גר '. מכולות ומכסי פלסטיק	חברת גביע יחיד	URC55-0090-0090 Pl4
1 גר '. מכולות ומכסי פלסטיק	DART מכולות תאגיד	100PC 100PCL25
1x PBS			137 המ"מ NaCl, 2.7 mM KCl, 8 מ"מ Na 2 HPO 4, 1.46 mM KH 2 4 ת.ד., 7.4 pH
מזרק	המילטון	80208	30 מד, 0.375 "אורך, סגנון נקודה 2