利用颅窗口，在可视化的大脑中动脉内皮素-1诱导大脑中动脉闭塞

摘要

本文介绍了一种方法，可视化的大鼠大脑中动脉通过颅窗颞部颅骨切除术，以大脑中动脉近端部分（图1）。这种多用途的方法可以结合与药物输送的各种技术来测量脑动脉反应性。

摘要

颅窗口的创建是一个方法，可以直接可视化结构的大脑皮质表面^1-3。这种技术可以覆盖的大鼠大脑在许多地方进行，但最容易地进行通过创建一个去骨瓣在容易获得额叶或顶叶骨头。最经常的是，我们已经使用了这种技术，组合与内皮素-1的大脑中动脉闭塞模型的缺血性中风的大脑中动脉的血管直径的变化所发生的脑实质与内皮素-1注入到相邻的近端MCA量化^4，5。为了形象化在内皮素-1诱导的缺血的MCA的近端部分中，我们使用一种技术，以通过颞骨大鼠颅骨外侧面（ 图1）上建立一个颅窗。脑动脉可与硬脑膜完整或与硬脑膜切开retra的的可视化反恐执行局。最常见的是，我们离开硬脑膜完整过程的可视化，因为内皮素1诱导脑缺血涉及到脑实质内的血管收缩肽交付。这将绕过切开硬脑膜直接在可视化血管药物输送的需要。该协议将介绍如何创建一个颅窗的可视化脑动脉一个逐步的时尚，以及如何避免许多关于这种方法的潜在缺陷。

研究方案

机构动物管理和使用委员会（IACUC）在佛罗里达大学和批准该协议是符合“指南的照顾和使用的实验动物”（第八版，美国国家科学院，2011年）。

物料

1. 动物：8周龄，雄性，只SD大鼠（查尔斯河农场，威​​尔明顿，MA，USA），体重250〜300克，手术时间。
2. 麻醉
   1. 吸入麻醉系统（VetEquip公司，普莱森顿，CA，USA）
   2. 异氟醚麻醉剂（巴克斯特制药，迪尔菲尔德，IL，USA）
3. 立体定位系统（大卫KOPF工具，图洪加，CA，USA）
   1. 小动物立体定位系统
   2. 非破裂大鼠耳棒
   3. 气体麻醉大鼠头支架
4. 温度调节
   1. BAT-12探针温度计（世界精密仪器公司，萨拉索塔，佛罗里达州，美国）
   2. T / PUMP，TP600热毯（Gaymar工业公司，果树园公园，NY，USA）
5. 手术器械
   1. 梅岑鲍姆剪刀，虹膜钳，斗牛犬钳拉钩，10μl注射器，26号斜口针，Bovie烧灼试剂盒（世界精密仪器公司，萨拉索塔，佛罗里达州，美国）
   2. 微电机钻（Stoelting，伍德戴尔，IL，USA）
   3. 0.8毫米的圆形钻牙钻（Roboz手术仪器有限公司，公司，盖瑟斯堡，MD，USA）
   4. STORZ，波恩缝合钳（博士伦公司，罗切斯特，NY，USA）
6. 手术用品
   1. 3.0尼龙线（绿洲，Mettawa，IL，USA）
   2. 棉拭子，Puralube的眼膏（默飞世尔科技，匹兹堡，PA，USA）
   3. 手术点和条（Xomed公司，杰克逊维尔，佛罗里达州，美国美敦力公司）
   4. 电推剪（奥斯特，普罗维登斯，RI，USA）
7. 化学制品
   1. 内皮素-1（美国多肽，桑尼维尔，CA，USA）
   2. 洗必泰2％（Agrilabs，圣若瑟，MO，USA）
8. 可视化设备
   1. 手术显微镜（塞勒仪器及制造，圣路易斯，MO，USA）
   2. 索尼HDR-SR12（索尼，千代田区，东京，日本）
   3. 光纤照明器（TechniQuip公司，利弗莫尔，CA，USA）
9. 测量血管直径
   1. VLC媒体播放器（巴黎，法国）
   2. Image J软件（ImageJ的1.42q软件，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，MA，USA）

1。术前步骤

1. 手术前，老鼠被安置在一个12:12的光/暗周期，可免费使用水和啮齿动物州城。
2. 麻醉诱导用4％的异氟醚在100％O _2的混合气体的感应室中。
3. 乌鸦 n的头被剃电推剪。
4. 大鼠置于俯卧趴在一个温度控制的操作表面（隔热层）和头部被放置在与放置气体麻醉面罩的立体定向装置开始位置上的吸收垫。
5. 接着，耳棒被插入并拧紧。
6. 在手术过程中麻醉维持在100％O _2的混合气体，用2％异氟烷。
7. 眼科润滑软膏的双眼，眼皮被关闭，以防止眼睛干燥，在手术过程中。
8. 探针插入直肠温度为37±0.5℃下，以保持恒定的动物核心温度
9. 与头牢固地保持在立体定位设备的麻醉大鼠的手术区是洁净其交替的洗必泰和盐水洗涤三次。

2。前颅窗准备

ontent颅创建一个窗口之前，应准备大鼠的任何其他所需的硬件植入实验，并应接受必要的外科手术。对于这个协议，我们先前已经植入了导套管内皮素-1（ET- 1）诱导脑缺血的配套出版物，题为“内皮素-1诱导大脑中动脉闭塞模型缺血性中风激光多普勒血流仪在大鼠指导。”

3。创建颅窗

放置的导向套管或设备所需的实验后，颅窗口创建直接可视化在行程过程中的中脑动脉的近端部分。

1. 首先，剪刀是用来覆盖开始向内侧颞肌和工作横向切开皮肤。
2. 颞肌使用电一分为二，然后缩回，用3.0尼龙线visua利泽的颞骨鳞状部分。
3. 约3-4平方毫米的鳞状部分颞骨尾鳍的轨道和卓越的颧突的基础上绘制的，因为它反映的颞骨。
4. 使用的钻头，逐步削减的轮廓从颞骨的骨片。应小心避免钻头施加太大的压力，因为它有可能损坏硬脑膜或大脑皮质。
5. 经常用无菌生理盐水进行冲洗，提高外科领域的可视化和防止经济过热的头骨。
6. 在一个松散的角落，开始的一块的temoporal骨被小心取出用细鼠齿钳，同时确保不与硬脑膜撕裂任何船只。
7. 硬脑膜原封不动和碎片用无菌盐水冲洗掉。

4。记录大脑中动脉收缩

帐篷“>为了演示如何捕获实时图像中，一个正在经历ET-1诱导脑缺血大鼠用于本协议。

1. 血管活性化合物的应用程序之前，应该记录的基准视频至少1分钟。对于ET-1诱导缺血，基线记录一旦针已进入脑实质降低，但是之前的ET-1的注射。
2. 开始注射的注射器泵，并记录为1小时，或直至所需的端点。针在视频录制期间，留在原地为了防止干扰焦平面。
3. 根据批准的协议，此过程应该是深度麻醉大鼠和安乐死。

5。图像分析

可确定血管直径的可视化MCA的任何部分。作为一个例子，我们将使用的MCA的一个分支，测量血管的直径在时间点前后ET-1注射。性病会从视频帧被捕获在1分钟的时间间隔，使用VLC媒体播放器（VideoLAN的）。

1. 安装VLC播放器并打开。
2. 通过选择工具，然后选择Preferences，将设置更改为“全部”下的“显示设置”。
3. “视频”菜单“中展开左侧边栏和”输出模块“，然后扩大。 “场景过滤器”带来现场视频滤镜菜单中选择。
4. “场景”中键入文件名前缀的框。
5. 目录路径前缀定义。这是保存静止帧。
6. 被选择的记录比基于静止帧捕获所需的速率。如果被抓获的视频每秒29帧，然后在“1749”（29帧/秒×60秒/分钟）应的方框中输入保存一个静止帧，每1分钟。所有的更改，然后保存。
7. 在VLC播放器，然后打开所需的视频自动保存静帧，每1分钟。
8. 然后，使用这些测量血管直径图像。首先，ImageJ软件（NIH）被打开。
9. 然后，你将测量的静帧，打开ImageJ的。
10. 选择“分析”菜单，“设置测量”，然后打开所有的箱子都没有选中。
11. 接着，将直线工具被选中。
12. 键盘快捷键的“Ctrl +”是用来在需要放大，一条线被置于垂直于容器路径测量血管直径。
13. 最后，船的长度是通过选择“分析”菜单，然后“措施”（Ctrl + M），以获得船只长度。
14. 这个过程被重复至少3次，取平均值为测量每个测量容器，在每个静止帧。
15. 被标准化为在每个时间点的血管直径，使基线血管直径的比较可以使用多个大鼠。要做到这一点，使用公式当前直径/基准直径×100％来计算的每艘船舶％的基准直径。

结果

静止图像捕获的视频显示取自脑动脉直径的变化后ET-1注射可以容易地理解，使用此颅窗技术（ 图2）。 ET-1注射在几分钟之内，该船将开始收缩。最终，船只将是很难想象的脑组织会变得苍白。大约20分钟后，ET-1的影响将减少，血管开始扩张，逐渐恢复到基线直径约45分钟后。除了发生比较明显的血管收缩，ET-1后管理，皮质表面变得苍白。如果需要的话，它可以在容器直径计算的绝对...

讨论

总之，这种颅窗制备技术是非常通用的，因为它可以被改变，以满足许多实验与细微的修改^4，5。例如，我们已经成功地监测脑血流量在特定的MCA分支，使用激光多普勒血流仪集中在一个的颅骨窗口（麦加AP 2009和2011年）通过观察大脑中动脉。此外，与硬脑膜阴刻类似的制剂可以使用血管活性化合物的局部给药，以创建一个在体内血管反应槽^3。有几个因素应予以考虑。制备?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
吸入麻醉系统	VetEquip公司，美国加利福尼亚州Pleasanton，	901806
异氟醚麻醉	巴克斯特制药，迪尔菲尔德，IL，USA	1001936060
小动物立体定位系统	大卫KOPF仪器，图洪加，CA，USA	900
非破裂耳酒吧，大鼠	大卫KOPF仪器，图洪加，CA，USA	957
气体麻醉大鼠头支架	大卫KOPF仪器，图洪加，CA，USA	1929年
BAT-12探针温度计	世界精密仪器公司，美国佛罗里达州，萨拉索塔，	BAT-12
T /泵，热毯	Gaymar工业公司，果树园公园，NY，USA	T / PUMP，TP600
梅岑鲍姆剪刀	世界精密仪器公司，美国佛罗里达州，萨拉索塔，	501254
虹膜镊子	世界精密仪器公司，美国佛罗里达州，萨拉索塔，	15915
斗牛犬钳拉钩	世界精密仪器公司，美国佛罗里达州，萨拉索塔，	14119-G
10μl注射器26 gaugue	世界精密仪器公司，美国佛罗里达州，萨拉索塔，	SGE010RNS
Bovie，高温烧灼套件	世界精密仪器公司，美国佛罗里达州，萨拉索塔，	500392
鼠齿钳0.12	Stotz	E1811
微电机钻	Stoelting，伍德戴尔，IL，USA	51449
0.8毫米的圆形钻牙钻	Roboz手术器械有限责任公司，美国马里兰州盖瑟斯堡，	RS-6280C-1
STORZ波恩缝合钳	博士伦公司，罗切斯特，NY，USA
尼龙线，尺寸3.0	绿洲，Mettawa，IL，USA	MV-663
棉签	默飞世尔科技，匹兹堡，PA，USA	22-029-488
Puralube眼膏	默飞世尔科技，匹兹堡，PA，USA	NC0138063
电推剪	奥斯特，普罗维登斯，RI，USA	78005-301
ET-1的80μM浓度在PBS中稀释至	美国多肽，桑尼维尔，CA，USA	88-1-10A
洗必泰，2％;	Agrilabs，圣若瑟，密苏里州，美国	1040，牧师6-06，NAC编号：10580322
手术显微镜	塞勒仪器制造，圣路易斯，MO，USA	演化XR6
索尼Handycam	索尼，日本东京都港区，	HDR-SR12
光纤照明	TechniQuip公司，利弗莫尔，CA，USA	FO1-150
VLC媒体播放器	（巴黎，法国）
Image J软件	美国国立健康，贝塞斯达，MA，USA