ניצול חלון גולגולת לדמיין עורק המוח האמצעי במהלך ספיג אנדותלין-1 מושרה מזרח מוחות עורקים

Summary

מאמר זה מתאר שיטה להמחשת עורקי חולדות מוחיים דרך חלון גולגולתי באמצעות craniectomy הזמני כדי להציג חלקים הפרוקסימלי של עורק המוח האמצעי ( איור 1). שיטה תכליתית זה יכול להיות בשילוב עם טכניקות שונות של החדרת תרופות למדידת תגובתיות עורק המוח In vivo.

Abstract

יצירת חלון גולגולתי היא שיטה המאפשרת הדמיה ישירה של מבנים על פני קליפת המוח של המוח ^1-3. טכניקה זו ניתן לבצע במקומות רבים המונחים על מוח החולדה, אבל מתבצעת בקלות על ידי יצירת craniectomy מעל העצמות הקדמיות או הקודקודית הנגישות בקלות. בתדירות הגבוהה ביותר, יש לנו להשתמש בטכניקה זו בשילוב עם מודל אנדותלין-1 עורק המוח האמצעי, החסימה של שבץ איסכמי לכמת את השינויים בקוטר כלי דם עורק מוח אמצעי, המתרחשים עם הזרקה של אנדותלין-1 לparenchyma המוח הסמוכים לMCA הפרוקסימלי ^{4, 5.} על מנת להמחיש את החלק הפרוקסימלי של MCA במהלך אנדותלין -1 המושרה MCAO, אנו משתמשים בטכניקה כדי ליצור חלון גולגולתי דרך העצם הטמפורלית בצד הלטרלי של גולגולת החולדה (איור 1). עורקי מוח יכולים להיות חזותי או עם דורה שלמה או עם הדורה החרוטה וretracted. בדרך כלל, אנו משאירים את הדורה שלמה במהלך ההדמיה מאז אנדותלין-1 המושרה MCAO כרוך מסירה של פפטיד vasoconstricting לparenchyma המוח. זה עוקף את הצורך לחתוך דורה ישירות לעבר הספינות דמיינו למשלוח סמים. פרוטוקול זה יתאר כיצד ליצור חלון גולגולתי לדמיין עורקים מוחיים באופנת צעד חכמה, כמו גם כיצד להימנע מרבות מהמלכודות הפוטנציאליות הנוגעות לשיטה זו.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי בעלי החיים והטיפול המוסדי ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת פלורידה ועומד ב" מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה "(8 מהדורה, האקדמיה הלאומית למדעים, 2011).

חומרים

1. בעלי חיים:, זכר, ספראג Dawley חולדות שמונה בן שבועות (River חוות צ'ארלס, Wilmington, מסצ'וסטס, ארה"ב) שוקלים 250-300 ג'בעת הניתוח.
2. הרדמה
   1. מערכת הרדמת משאיפת (VetEquip Inc, Pleasanton, קליפורניה, ארה"ב)
   2. הרדמת isoflurane (רוקחות בקסטר, Deerfield, IL, ארצות הברית)
3. Stereotaxic המערכת (דוד קופף מכשירים, Tujunga, קליפורניה, ארה"ב)
   1. מערכת stereotaxic חיה קטנה
   2. ברים ללא קרע אוזן לחולדות
   3. בעל ראש הרדמת גז לחולדות
4. ויסות טמפרטורה
   1. 12-BAT מדחום microprobe (העולםPrecision מכשירים, Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב)
   2. T / משאבה, TP600 שמיכת תרמית (Gaymar תעשיות, Inc, אורצ'רד הפרק, ניו יורק, ארה"ב)
5. מכשירי ניתוח
   1. מספרי צנבאום, איריס מלקחיים, מפשק מהדק בולדוג, 10 מזרק עם מחט μl 26 מד קטומה, Bovie כוויית ערכה (עולם Precision מכשירים, Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב)
   2. Micromotor תרגיל (Stoelting, עץ דייל, אילינוי, ארה"ב)
   3. 0.8 מ"מ סיבוב מקדחת הספחת (Roboz כירורגי Instrument ושות, Inc, גייתרסבורג, מרילנד, ארה"ב)
   4. Storz בון תפירת מלקחיים (באוש וLomb, Inc, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב)
6. ציוד כירורגי
   1. 3.0 ניילון תפר (אואזיס, Mettawa, אילינוי, ארה"ב)
   2. ספוגיות כותנה, משחת העין Puralube (הפישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב)
   3. נקודות ורצועות כירורגיות (מדטרוניק Xomed, Inc, ג'קסונוויל, פלורידה, ארה"ב)
   4. קוצץ שיער חשמלי (אוסטר, פרובידנס, רוד איילנד, ארה"ב)
7. כימיקלים
   1. אנדותלין-1 (האמריקאי פפטיד, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב)
   2. כלורהקסידין 2% (Agrilabs, סנט ג'וזף, מיזורי, ארה"ב)
8. ציוד הדמיה
   1. מיקרוסקופ הניתוחי (כלי סיילר וייצור; סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (סוני, מינאטו, טוקיו, יפן)
   3. פנס סיבים אופטי (TechniQuip קורפ, ליברמור, קליפורניה, ארה"ב)
9. מדידת קוטר כלי
   1. VLC Media Player (פריז, צרפת)
   2. תמונת J תוכנה (ImageJ 1.42q תוכנה, מכוני בריאות הלאומי של ארה"ב, Bethesda, מסצ'וסטס, ארה"ב)

1. צעדים טרום ניתוחיים

1. לפני הניתוח, החולדות הם שוכנו במחזור 12:12 אור / חושך עם גישה חופשיה למים והמכרסם צ'או.
2. הרדמה מושרה עם 4% isoflurane ב% תערובת 100 O ₂ גז בתא אינדוקציה.
3. העורב n של ראשו מגולח עם קוצץ שיער חשמלי.
4. העכברוש שם בתנוחת שכיבה על משטח סופג שוכב על משטח טמפרטורה מבוקרת הפעלה (שמיכת תרמית) והראש ממוקם במנגנון stereotactic מתחיל עם מיקום של מסיכת הרדמת הגז.
5. בשלב בא, בארי האוזן מוכנסים והתהדקו.
6. במהלך הרדמת ההליך נשמר עם 2% isoflurane ב% תערובת גז 100 O _2.
7. משחת הסיכה Opthalmic מוחלת על שתי העיניים והעפעפיים סגורים כדי למנוע התייבשות עין במהלך ההליך הכירורגי.
8. בדיקה רקטלית טמפרטורה מוכנסת לשמור על טמפרטורת ליבת חיה קבועה של 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס
9. עם הראש של החולדה המורדמת בחוזקה במכשיר stereotaxic אזור הניתוח מתנקה עם לסירוגין שלוש פעמי כלורהקסידין ומלוחות.

2. הכנה מראש חלון גולגולתי

ontent "> לפני יצירת חלון גולגולתי, העכברוש צריך להיות מוכן לכל ניסויים על ידי השתלה של חומרה הנדרשת אחרת וצריך לקבל את כל ניתוחים דרושים. לפרוטוקול זה, יש לנו מושתל צינורית מדריך בעבר לאנדותלין-1 (ET- 1) המושרה MCAO כפי שמוצג בפרסום לוויה תחת כותרת "מודל אנדותלין-1 מושרה מזרח מוחות עורקים ספיגים לשבץ איסכמי עם הדרכת Flowmetry ליזר דופלר בחולדה".

3. יצירת חלון הגולגולת

לאחר מיקום של צינורית או ציוד דרוש לשם ניסויי מדריך, חלון גולגולתי נוצר ישירות לדמיין חלקים הפרוקסימלי של עורק המוח האמצעי במהלך הליך שבץ.

1. ראשית, מספריים משמשים לחתוך עור שמעל שריר temporalis מתחיל מדיאלית ועבודה רוחבית.
2. שרירי temporalis הוא נחצה באמצעות electrocautery ולאחר מכן חזרו בו באמצעות תפר ניילון 3.0 ל visua ליזה חלק הקשקש של העצם הטמפורלית.
3. כיכר מ"מ כ 3-4 נמשכת על חלק הקשקש של עצם הזנב למסלול וינעל על הבסיס של תהליך הזיגומטית הזמני שכן הוא משקף הנחה של העצם הטמפורלית.
4. קידוח משמש לחתוך חתיכה התוותה של עצם בהדרגה חופשיה מהעצם הטמפורלית. יש להקפיד להימנע מיישום יותר מדי לחץ לתרגיל שכן הוא עלול להינזק הדורה או קליפת מוח.
5. שטיפות תכופות עם תמיסת מלח סטרילית מבוצעות כדי לשפר את ההדמיה של שדה הניתוח ולמנוע התחממות יתר של הגולגולת.
6. החל בפינה רופפת, חתיכת עצם temoporal מוסרת בזהירות בעזרת מלקחיים עדינים עכברוש שיניים תוך הקפדה שלא לקרוע שום כולים קשורים בדורה.
7. הדורה נותרה בשלמותו והפסולת שטפה באמצעות סליין סטרילי.

4. הקלטה של ​​התכווצות עורק המוח

> אוהל "כדי להדגים כיצד ללכוד תמונות בזמן אמת, עכברוש שעובר ET-1 המושרה MCAO משמש עבור פרוטוקול זה.

1. לפני היישום של תרכובות vasoactive, וידאו בסיסי צריך להיות מוקלט לדקות לפחות 1. לET-1 המושרה MCAO, ההקלטה הבסיסית נעשית פעם אחת המחט הופחתה לparenchyma המוח אבל לפני הזרקת ET-1.
2. משאבת המזרק הוא התחיל להזרקה ונרשמה ל1 שעה או עד לנקודת הסיום הרצוי. המחט נשארה במקומו בזמן הקלטת וידאו על מנת למנוע הפרעות במישור המוקד.
3. החולדה צריכה להיות עמוק מורדמת ולהרדים פי פרוטוקול שאושר בעקבות הליך זה.

5. ניתוח תמונה

קוטר כלי ניתן לקבוע לכל חלק של MCA דמיין. כדוגמה, אנו נשתמש בסניף אחד של MCA למדוד קוטר כלי בזמן נקודות לפני ולאחר הזרקת ET-1. Stiמסגרות ll מהווידאו שנתפסו במרווחי 1 דקות באמצעות VLC Media Player (VideoLAN).

1. VLC הנגן מותקן ונפתח.
2. על ידי בחירת כלים ואז העדפות, ההגדרה משתנית "כל" תחת "הגדרות צג".
3. "תפריט הווידאו" מתרחב בסרגל השמאלי ו" מודולים פלט "הוא לאחר מכן הרחיב. "מסנני Scene" נבחרו כדי להעלות את תפריט מסנן וידאו הסצנה.
4. "סצנות" שהוקלדה לתוך התיבה לקידומת שם קובץ.
5. קידומת נתיב ספרייה מוגדרת. זה המקום בו עדיין נשמרות מסגרות.
6. יחס הקלטה נבחר בהתבסס על השיעור הרצוי של מסגרת ללכוד עדיין. אם וידאו נכבש ב 29 מסגרות לשנייה, ואז "1749" (29 פריימים / שני x 60 שניות / דקות) יש להזין בתיבה כדי להציל אחד עדיין למסגר כל 1 דקות. כל השינויים ואז נשמרים.
7. אז וידאו הרצוי נפתח בנגן VLC כדי לשמור באופן אוטומטי עדיין מסגרות פעם בדקות 1.
8. אז קוטר כלי נמדד באמצעות אלהתמונות. ראשית, ImageJ תוכנה (NIH) נפתחה.
9. אז עדיין מסגרות שתמדדו נפתחות בImageJ.
10. על ידי בחירה בתפריט "לנתח", "להגדיר מדידות" ואז הוא נפתח וכל התיבות אינן מבוקרות.
11. בשלב הבא, כלי הקו הישר מסומן.
12. קיצור המקשים "Ctrl +" משמש כדי להגדיל בהתאם לצורך וקו ממוקם בניצב לשביל הכלי למדידת קוטר כלי.
13. לבסוף, אורך כלי מתקבל על ידי בחירה בתפריט "לנתח" ולאחר מכן "מדד" (Ctrl + M) כדי להשיג אורך כלי.
14. תהליך זה חוזר על עצמו לפחות שלוש פעמים בממוצע עבור כל כלי נמדד נמדד בכל מסגרת עדיין.
15. קוטר כלי בכל נקודת זמן מנורמל לקוטר הכלי הבסיסי כל כך שניתן לעשות שימוש בחולדות השוואות מרובות. כדי לעשות זאת, השתמש בקוטר הקוטר / בסיס הנוסחא הנוכחי x 100% כדי לחשב את קוטר בסיס% מכל כלי.

תוצאות

עדיין תמונות שנלקחו מתכנית הווידאו שנתפס כי השינוי בקוטר עורק מוח לאחר הזרקת ET-1 יכולה להיות מוערכת בקלות באמצעות טכניקה זו גולגולת חלון (איור 2). בתוך דקות של הזרקת ET-1, הכולים יתחילו להתכווץ. סופו של דבר את הכולים קשים יהיו לדמיין ורקמת המוח תהפוך חיוורת. לאחר...

Discussion

לסיכום, חלון טכניקת הכנת גולגולת זו היא מגוונת מאוד כפי שניתן לשנות כדי לענות על הצרכים של ניסויים רבים עם שינויים קלים ^{4, 5.} לדוגמה, יש לנו מעקב זרימת דם במוח בהצלחה בענפים ספציפיים MCA באמצעות flowmetry דופלר הליזר להתמקד ישירות בעורק מוח דמיין דרך חלון גולגולתי (מכת A...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
מערכת הרדמת משאיפת	VetEquip Inc, Pleasanton, קליפורניה, ארה"ב	901806
הרדמת isoflurane	רוקחות בקסטר, Deerfield, אילינוי, ארה"ב	1001936060
מערכת stereotaxic חיה קטנה	דוד קופף מכשירים, Tujunga, קליפורניה, ארה"ב	900
ללא קרע ברי אוזן, חולדה	דוד קופף מכשירים, Tujunga, קליפורניה, ארה"ב	957
בעל ראש הרדמת גז עכברוש	דוד קופף מכשירים, Tujunga, קליפורניה, ארה"ב	1929
BAT-12 מדחום microprobe	עולם מכשירי דיוק, Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	BAT-12
T / משאבה, שמיכת תרמית	Gaymar תעשיות, Inc, אורצ'רד הפרק, ניו יורק, ארה"ב	T / משאבה, TP600
מספרי צנבאום	עולם מכשירי דיוק, Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	501254
איריס מלקחיים	עולם מכשירי דיוק, Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	15915
מפשק בולדוג המהדק	עולם מכשירי דיוק, Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	14119-G
10 מזרק μl 26-gaugue	עולם מכשירי דיוק, Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	SGE010RNS
Bovie, ערכת כוויית חום גבוהה	עולם מכשירי דיוק, Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	500392
שן עכברוש מלקחיים 0.12	Stotz	E1811
תרגיל micromotor	Stoelting,ווד דייל, אילינוי, ארה"ב	51449
סיבוב ספחת מקדח 0.8 מ"מ	Roboz כירורגי Instrument ושות, Inc, גייתרסבורג, מרילנד, ארה"ב	RS-6280C-1
Storz בון suturing מלקחיים	באוש וLomb, Inc, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב
ניילון תפר, גודל 3.0	אואזיס, Mettawa, אילינוי, ארה"ב	MV-663
ספוגיות כותנה	הפישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב	22-029-488
משחת עיני Puralube	הפישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב	NC0138063
קוצץ שיער חשמלי	אוסטר, פרובידנס, רוד איילנד, ארה"ב	78005-301
ET-1 לדילול ריכוז M μ 80 ב PBS	האמריקאי פפטיד, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב	88-1-10A
כלורהקסידין, 2%	Agrilabs, סנט ג'וזף, מיזורי, ארה"ב	1040, 6-06 כומר, NAC מספר: 10580322
מיקרוסקופ הניתוחי	זיילר כלי וייצור, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	אבולוצית xR6
Sony Handycam	סוני, מינאטו, טוקיו, יפן	HDR-SR12
פנס סיבים אופטי	TechniQuip קורפ, ליברמור, קליפורניה, ארה"ב	FO1-150
VLC Media Player	(פריז, צרפת)
תמונת J תוכנה	ארה"ב מכונים הלאומיים לבריאות, Bethesda, מסצ'וסטס, ארה"ב