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摘要

这种技术提供了一种方法来收集，标准化和量化，自然原虫的宿主细胞培养的哺乳动物细胞感染前细胞内生长的细菌病原体。此方法可以被修改，以适应各种各样的起动阶段，以及靶细胞类型的宿主细胞。

摘要

许多细胞内的细菌病原体使用淡水原生动物作为一种天然水库增殖的环境中。退伍军人肺炎的病原体，获得了嗜肺军团菌 ，当第一次收获之前感染的哺乳动物巨噬细胞的原生动物细胞在体外培养的细菌的致病性优势。这表明可能无法正确地在体外表达，重要的毒力因子。我们已经开发出一种易于处理系统吸L.肺通过其自然的原生主机棘阿米巴castellanii之前哺乳动物细胞的感染。任何毒力因子的贡献可以被检查原生动物吸后，通过比较的突变株的细胞内生长的野生型细菌。表达GFP的野生型和突变型L。杆菌菌株用于感染原生动物的单分子膜在一个起动步骤，并允许达到的细胞内生长的后期。荧光的细菌从这些受感染的细胞，然后收获归一分光光度法产生相当数量的细菌到哺乳动物的巨噬细胞的继发感染。对于定量分析进行监测，活菌感染后，用荧光显微镜，流式细胞术，通过菌落镀敷。这种技术强调和依赖于宿主细胞相关的基因表达，通过模仿的环境，会遇到一个自然的收购路线的贡献。这种方法可以被修改，以适应使用媒介主机的任何细菌，作为一个装置，用于获得的致病优势。

引言

大量的细菌病原体已经适应了广义的策略，利用宿主细胞，在细胞内生存和复制。在许多情况下，致病机制原生动物和后生动物的细胞之间的相似。然而，这两个微环境是非常不同的，并可能导致在毒力因子的差异表达1-4。退伍军人症细菌嗜肺军团菌广泛存在与世界各地的淡水环境5。更重要的是，L.原生动物细胞培养在肺感染的人类单核细胞中获得的致病优势之前，表明全局基因表达谱的退出原生动物细胞的细菌在体外培育生物体6-8比是不同的。在自然界中，淡水变形虫快速扩增细菌入侵提供营养丰富的局限。人类收购L. pneumophILA是最常见的吸入受污染的水含有细菌的水滴，。这很可能是这些水滴港口原生动物细胞相关的细菌，原生动物细胞更耐常规水处理的做法9,10。感染的肺泡巨噬细胞原生动物宿主细胞11-13中的细菌的细胞内的生命周期几乎相同的方式进行。

为了生存，并在真核细胞中复制，L.肺使用一个专门的IVB型分泌系统，称为点/ ICM提供近300'效应蛋白进入宿主细胞的细胞质中14-16。这些效应蛋白统称颠覆细胞过程中，为了产生一个复制许可为细菌的隔室17,18的功能。在任意的26个基因，包括在细胞内的多个缺陷的菌株的Dot / Icm的转运结果删除iplication 19日至23日 。从历史上看，删除的个体效应编码基因很少株弱毒细胞内生长。这种现象被归结为几种假说的效应，包括冗余的功能和同源的副本。

有些毒力因子只表示的上下文中的宿主细胞相关的细胞内生长24。我们合理化，如果一个特定的效应，只表示的上下文中的原虫感染，然后的效应的贡献可能不能的野生型菌株相比，当两个进行体外培养。嗜肺军团菌的复制转换透射阶段进入稳定期文化25。相开关型过程中遇到的细胞内生长的养分消耗，，通过组装鞭毛活力26的例子。由于L.肺是INVA西伯和原生动物细胞致命的收获时，我们寻求发展的分析，更忠实地代表了致病状态，当它遇到的细菌宿主巨噬细胞。

为此，我们开发了一种多用途的的原生动物吸试验，可以适应任何合适的宿主同时为第一（涂刷细胞）和第二阶段（靶细胞）感染。通过使用稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的细菌感染的过程中易于处理。原生动物棘阿米巴castellanii感染模型如下的字段27中广泛使用的一种方法。对于吸步骤，L.杆菌菌株在体外培养，以在液体介质中的固定相，以产生标记为“透射”细菌（ 图1A）。接下来，细菌感染单层A. castellanii 18小时来实现的细胞内的生命周期的后期阶段。大液泡包含ING细菌可以被可视化，在该时间点，使用荧光显微镜（ 图1A）。原生动物细胞，然后裂解，从裂解物中回收的细菌测定使用荧光板读数器在512 nm的发射。荧光光密度与多重性感染（MOI）感染的靶细胞（ 图1，*的相关性曲线）来计算。入侵后（T 18）入侵（T 0），18小时后，靶细胞的荧光定量，代表细胞内的细菌。可以监视荧光显微镜和流式细胞仪，活菌数可通过殖民地电镀测量。吸分析总是伴随着感染与野生型L.肺的Dot / Icm的IV型分泌系统（ΔDOTA）（ 图1A）中的缺陷的菌株。重要的是提供内部控制之间的直接比较野生型aND任何等位基因突变株在感染过程中使用。在起动阶段期间的无毒ΔDOTA应变列入设置观察衰减等基因突变株， 在体外培养生长的表型相关的一个阈值。

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研究方案

1。引发阶段感染嗜肺军团菌文化制备

  1. 将所有L.肺用质粒pAM239在测定中使用的菌株，编码的异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导的绿色荧光蛋白（GFP）28。条纹到铁和半胱氨酸的细菌菌株补充缓冲木炭酵母提取物琼脂（实业家）含有6.25微克/毫升氯霉素（CM）（用于质粒维护），并孵育72 N-（2 -乙酰氨基）-2 -氨基乙磺酸（ACES）小时，在37°C。
  2. 转移的种菌的菌株成补充ACES缓冲与6.25微克/毫升CM和1mM IPTG的酵母提取物肉汤（AYE），培养在37℃下固定相（O / N）在轨道摇床
  3. 确认在体外培养物中，使用荧光显微镜的GFP表达。盖下培养10微升转移到载玻片上单和图像，使用60X与GFP激发/发射立方体（AMG EVOS佛罗里达州）的目标。
  4. 稀释100微升等分每个体外培养至1:10使用无菌H 2 O。用1mM IPTG和6.25微克/毫升厘米和水作空白用100μlAYE的媒体。以OD600值测量的稀释液用分光光度计（Bio-Rad公司智能规格加）。必要计算其体积，以MOI = 20感染的以及为每个在体外培养中：V = [（阿米巴种子）×MOI] / [OD 600×（稀释倍数）×（常数）] = [（1×10 6个 ）×（20）] / [OD 600×（10）×（1×10 6）] = 2/OD 600。浓度的细菌被确定为OD 600 = 1.0 = 1×10 9 CFU /毫升。

2。感染棘阿米巴castellanii的引发阶段

  1. 维护和ATCC 712 PYG培养基中的变形虫在175厘米2瓶中，在室温下培养。
  2. 更换介质变形虫尽头Tures的前24小时开始的细菌液体培养。就在同一天液细菌培养，收集和使用血球计数仪，光镜下细胞计数。
  3. 变形虫用新鲜培养基稀释至终浓度为1×10 6细胞/ ml。种子的12孔细胞培养板中，用1​​毫升等分的阿米巴使用一个repeat移液器并孵育在RT下的O / N。
  4. 孵育后，洗3倍与1毫升无菌PBS中，使用了10毫升血清移液管和一个手动移液管辅助的12孔细胞培养板的孔中。
  5. 抽吸的PBS后，加1ml的感染介质（ATCC 712 PYG媒体减去葡萄糖，蛋白胨，酵母提取物），用1mM IPTG和6.25微克/毫升cm到每个孔中。在RT下孵育板1小时。
  6. MOI = 20感染井。离心板400×g离心5分钟（Eppendorf公司5810R）和漂浮在37℃水浴5分钟。转移板在37℃，5％CO 2的培养箱中培养18小时。
  7. 使用活细胞成像在荧光显微镜下的细菌宿主细胞裂解和收获之前确认的感染。

3。播种THP-1细胞为靶细胞阶段感染

  1. （这个过程开始前24小时，液细菌培养）。 75 cm 2的培养瓶中近会合在与10％热灭活的小牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中培养THP-1细胞。
  2. 使用血细胞计数器计数悬浮细胞，含10％FBS和100 ng / ml的佛波醇-12 -肉豆蔻酸酯-13 -乙酸酯（PMA）的浓度为1×10 6细胞/ ml THP-1细胞在RPMI 1640培养基稀释，并在1毫升的等分试样在12孔细胞培养板的板。孵育48小时的板在37℃下，5％CO 2。

4。目标细胞阶段感染，细菌感染的起动阶段后处理

  1. 吸取媒体的引物变形虫。
  2. 裂解一moebae使用500μl的冰冷，无菌超滤（UF）H 2 O和孵育在室温下10分钟。
  3. 普尔的裂解物，根据应变类型和采取的E 512 nm的测量为每个池的溶胞产物用荧光板读数器（Molecular Devices公司酶标仪双子座EM）。
  4. 计算OD 600项测试的汇集裂解calcOD 600 = 0.0008（E 512 -裂解背景）+ 0.0019。预先确定的公式，通过图形的直接比较的OD 600和E 512 nm的测量稀释的L.肺野生型表达绿色荧光蛋白， 在体外培养固定相（ 图1）。裂解物的未感染的变形虫，受到相同的实验条件下，受感染的变形虫，作为空白，并提供了一个修正值（ 例如，溶胞产物的背景），将其纳入方程。所需的体积吨ò感染在阱的MOI = 20时为每个溶解物游泳池计算：V = [（THP-1种子）所述MOI] / [calcOD 600×（常数）] = [（1×10 6）×（20）] ，/ [calcOD 600×（1×10 6）] = 20 / calcOD 600。
  5. 在THP-1细胞的3倍，用PBS洗净，向每孔加入1毫升的新鲜RPMI 1640培养基（10％FBS）。孵育THP-1细胞，在37℃下1小时，5％CO 2。
  6. 感染的THP-1细胞，在所计算出的MOI使用汇集的溶胞产物。允许一组井保持感染，作为流式细胞分析的阴性对照。应在不到30分钟内完成处理的起动阶段。裂解液置于冰上，感染前，以限制任何细菌基因表达的变化。
  7. 离心板，浮动，以提高温度和孵化，在起动阶段。
  8. 感染后一小时，取出媒体的愿望和3次PBS删除胞外细菌，洗井。
  9. 加入1毫升频率sh的RPMI 1640培养液（10％FBS），井和返回板的培养箱。后立即更换媒体的时间作为时间零点（T 0）。孵育14-16小时的THP-1细胞在37℃下，5％CO 2。

5。实验分析

5.1活细胞成像

图像受感染的井用荧光显微镜（AMG EVOS佛罗里达州）10X或20X放大倍数（ 图1A-D）。这些图像可以被定量或定性的比较，以确定在起动阶段和靶细胞阶段感染感染水平。

5.2流式细胞仪

  1. 可以比较流式细胞仪（BD FACS刀魂）的发射峰不同的感染。 Trypsinize受感染的THP-1细胞，并从孔中通过在PBS中混合，用移液管轻轻地清洗。
  2. 游泳池的应变类型的细胞15毫升Falcon管和球团在1800 XG 2分钟在台式离心机。
  3. 暂停颗粒在1毫升PBS，并转移到1.5 ml离心管中。
  4. 为1800 X G（Eppendorf公司5424）和离心悬浮液，重新悬浮于1ml PBS颗粒。如果所得到的悬浮液高度浑浊（≥1.0的OD 600），他们必须额外PBS（1:3）稀释，在流式细胞仪中的线，以防止堵塞。
  5. 使用无菌过滤PBS平衡的流式细胞仪和洗涤步骤之间的样品进样。绘制的正向/侧向散射未受感染的靶细胞的靶细胞感染样品注射之前。
  6. 收集20000事件总数为每个条件使用488 nm激光激发和FL1通道。
  7. 栅极捕获后的细胞群，以排除未感染的细胞和情节在直方图中的荧光强度（FlowJo）（ 图1E）。

5.3 CFU电镀

  1. 检查的效率of感染CFU电镀流式细胞收获细胞。准备样品的系列稀释液在超过滤的H 2 O在10 -1，10 -2，10 -3。
  2. 板20μl的每个稀释到1/3的实业家板与6.25微克/毫升CM。
  3. 板在37℃下孵育72小时。
  4. 用牙签和细胞计数器计数的殖民地。

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结果

为整个感染过程的一个典型的结果是在图1中概述。活细胞的荧光显微照片描绘单层A.castellanii感染野生型L。肺在起动阶段，在图1A中所示。一个成功的措施的起动步骤会导致人口的约90％的宿主细胞中含有大量空泡人口与绿色荧光蛋白标记的细菌在此MOI。在感染后18小时，A. castellanii细胞，细菌负荷达到最大，但裂解的人口是最少的。在光学显微镜下，?...

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讨论

细菌基因表达被严密控制的生命周期的进展和响应周围的微环境中的信号通过一个组合。液泡的病原体，如L.肺应对多种宿主细胞衍生的线索条块中的吞噬体时。由于在宿主细胞中的营养耗竭集体结果，细菌随后的宿主细胞，25表示成功传播所需的因素进行补偿。L。肺适于有效地寄生原生动物细胞各种各样的，因此窝藏效应蛋白的一个广泛的目录来驱动此过程。这些效应蛋白...

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披露声明

作者宣称，他们没有竞争的金融利益。

致谢

我们感谢克雷格·罗伊博士和博士达里奥·赞博尼提供的模板原生动物细胞感染。我们感谢贾格迪普Obhrai博士，博士乔治安娜·珀迪，弗雷德·赫夫龙博士和托德·威斯纳设备和试剂;露露罗纳博士的手稿严格审查。流式细胞术在OHSU的流式细胞仪共享资源设施。这项工作是支持的，由俄勒冈州医学研究基金会和美国国立卫生研究院授予R21 AI088275（EDC）的资助。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
chloramphenicolFisher ScientificBP904-100antibiotic
IPTGFisher ScientificBP1755-10
ACESSigmaA9758-1KGmedia component
ATCC medium: 712 PYGATCCgrowth media for protozoans
1X PBSFisher ScientificSH30256FSphosphate buffered saline
activated charcoalFisher ScientificC272-212media component
yeast extractFisher ScientificBP1422-500media component
peptoneBD Diagnostics211677media component
agarFisher ScientificBP1423-2media component
L-cysteine, 99%+Acros organics173601000media supplement
Ferric nitrate nonahydrateFisher ScientificI110-100media supplement
Equipment
EVOS flAMGEVOS flfluorescence microscope
Smart Spec PlusBio-Rad170-2525spectrophotometer
5810 R centrifugeEppendorf22627023bench top centrifuge
Repeater plusEppendorf22230201repeating pipette
SpectraMax Gemini EMMolecular Devicesmicroplate reader
Softmax Pro 5.3Molecular Devices0200-310microplate reader software
5424 microfugeEppendorf22620401table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump IIScienceware379111010pipette aid
FACS CaliburBD Bioscienceflow cytometer
FlowJo 7.6.1FlowJolicenseflow cytometery software
15 ml tubeBD Falcon352096polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tubeNeptune3745.Xmicrocentrifuge tubes

参考文献

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