原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

要約

この手法は、収穫する方法を提供するものであり、哺乳動物細胞の感染に先立って自然原虫の宿主細胞にあらかじめ栽培されている細菌性病原体の細胞内増殖を正常化し、定量化する。このメソッドは、プライミング段階のための宿主細胞、ならびに標的細胞の種類の多種多様に対応するように変更することができます。

要約

多くの細胞内細菌の病原体は、環境中で増殖のための自然宿主として淡水原生動物を使用するレジオネラ·ニューモフィラ 、レジオネラ肺炎の病原体は、第1の従来哺乳類のマクロファージの感染原虫の細胞から採取し体外培養細菌の過病原性の利点を得る。このことは重要な病原因子が適切にin vitroで発現されないことを示唆している。我々は、プライミングLの扱いやすいシステムを開発した哺乳動物細胞に感染し、その自然宿主原虫カステラーニアメーバを通じてpneumophilaの前。任意の病原因子の寄与は原虫プライミング後に野生型細菌に変異株の細胞内増殖を比較することによって調べることができます。 GFPを発現する野生型と変異型のL. pneumophilaの株はプライミング工程で単層原虫を感染させるために使用され、細胞内増殖の後期段階に到達するために許可されている。蛍光細菌は、これらの感染細胞から採取し、哺乳類のマクロファージへのその後の感染の細菌の匹敵する数値を生成する分光光度法によって正規化されています。定量では、生きた細菌を蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、およびコロニーめっきによりを用いて感染後に監視されています。この手法は、強調表示され、天然の取得経路で遭遇するであろう環境を模倣することにより、宿主細胞依存性遺伝子発現の寄与に依存しています。このアプローチは、病原性の優位性を得るための手段として、中間宿主を使用するすべての細菌に対応するように変更することができます。

概要

多数の細菌性病原体は、細胞内コンパートメントの生存と複製のための宿主細胞を悪用するための一般的な戦略を適応している。多くの例では、病原性のメカニズムは原生動物と後生動物の細胞との間の類似している。ただし、これら二つの微小環境は非常に異なっていると^1-4毒性因子の発現差異をもたらすことができます。レジオネラ症細菌レジオネラは遍在⁵世界中の淡水環境に関連付けられています。重要なのは、L.原生動物の細胞を出細菌のその全体的な遺伝子発現プロファイルを示唆して、病原性の優位性を得るヒト単球の感染前に原生動物細胞で栽培pneumophilaのは、生物^6-8栽培におけるin vitroのそれよりも異なっている。自然界では、淡水のアメーバは、侵入細菌の迅速増幅のための栄養豊富な範囲を提供します。 Lの人間買収pneumophILAは、ほとんどの場合、細菌が含まれている汚染された水滴の吸入に起因すると考えられる。それは、これらの液滴港原虫細胞関連細菌がいる可能性があり、原生動物の細胞は^9,10従来の水処理慣行に対してより耐性がある場所。 ^11月13日原虫の宿主細胞における細菌の細胞内のライフサイクルとほぼ同じ方法で、肺胞マクロファージが進むの感染。

生き残るためには、真核細胞内で複製するために、L.レジオネラは、宿主細胞の細胞質に^{14から16まで}約300の"エフェクター"タンパク質を提供するドット/ ICMと呼ばれる特殊なタイプのIVbの分泌系を使用しています。これらのエフェクタータンパク質を総称細菌^17,18のレプリケーション寛容なコンパートメントを生成するために、細胞プロセスを打倒するために機能する。細胞内MULTための欠損株でドット/ ICMトランスポーター結果を構成する26の遺伝子のいずれかの欠失iplication ^{19から23。}歴史的には、個々のエフェクターをコードする遺伝子の欠失はほとんど細胞内増殖のための弱毒株をもたらしません。この現象は、冗長機能やエフェクターのパラロガスコピーを含むいくつかの仮説に起因している。

いくつかの病原因子は、宿主細胞関連細胞内増殖²⁴の文脈で表現されます。私たちは、特定のエフェクターのみ ​​原虫感染の文脈で表現されていた場合、エフェクターの寄与の両方をin vitroで培養した野生型株と比較することができなかったことを合理化した。それは文化²⁵に固定相に入ると複製から透過位相にはL. pneumophila遷移します。フェーズのスイッチング·表現型は、細胞内の成長中に発生した、運動性²⁶の鞭毛のアセンブリを介して例示されている栄養の枯渇を表しています。なぜならL.レジオネラはもっとINVAですsiveと病原性原虫の細胞から採取したときに、私たちは、それが宿主のマクロファージに遭遇したときに、より忠実に細菌の病原性の状態を表現してアッセイを開発しようとした。

この目的のために、我々は両方（標的細胞）最初（プライミングセル）と第2段の感染症のための任意の適切なホストを収容することができる汎用性の高い原虫プライミングアッセイを開発した。感染プロセスが安定して緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する細菌の使用を介して扱いやすいです。原虫カステラーニアメーバの感染モデルが広くフィールド²⁷で用いられた方法論に従っています。プライミング工程、Lのpneumophilaの株はラベルの付いた"透過"バクテリア（ 図1A）を生成するために、液体媒体中の固定相にin vitroで培養される。細菌は、次のAの単層を感染させるために使用されている細胞内のライフサイクルの後期を達成するために、18時間カステラーニ 。大きな空胞は含まれている細菌は蛍光顕微鏡（ 図1A）を使用して、この時点で可視化することができる。原生動物の細胞は、その後溶解し、溶解物から回収された細菌を蛍光プレートリーダーを用いて512 nmでの発光のために測定されています。蛍光は、標的細胞の感染（ 図1、*相関曲線）の多重オブ感染度（MOI）を計算するために光学濃度と相関している。浸潤（T _0）と18時間後の浸潤（T _18）の後に、標的細胞は細胞内細菌を表す、蛍光を定量化する。蛍光を顕微鏡およびフローサイトメトリーによって監視することができ、生菌数をコロニーメッキを介して測定することができます。プライミングアッセイは常に野生型Lで感染症を伴っているニューモとドット/ ICM IV型分泌系（ΔDOTA）（ 図1A）における欠損株。これは重要なことは、野生型との間の直接比較のための内部統制を提供ND感染過程で使用される任意の同質遺伝子変異株。プライミング段階で無毒ΔDOTA株を含めることは、in vitroで培養する同質遺伝子変異株に関連付けられた弱毒成長の表現型を観察するためのしきい値を設定します。

プロトコル

1。プライミング段階の感染症のためのレジオネラ培養物の調製

1. すべてのLを変換イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）をコードするプラスミドpAM239を用いたアッセイで使用pneumophilaの株は 、緑色蛍光タンパク質^{（GFP）28を}誘導。鉄及びシステインへ菌株が補わストリークして、N-（2 -アセトアミド）-2 -アミノエタンスルホン酸（ACES）6.25μg/ mlのクロラムフェニコール（Cm）（プラスミドメンテナンス用）、72インキュベートを含む緩衝木炭酵母エキス寒天（CYEA） 37のhr℃、
2. 6.25μg/ mlのCMと1mM IPTGで酵母エキスブロス（AYE）バッファリングされ、37℃でオービタルシェーカー上に固定相（O / N）を養う℃に補わACEに菌株の接種を転送
3. 蛍光顕微鏡を用いたin vitro培養でGFPの発現を確認してください。カバーの下のスライドガラス上に培養液の10μlをGFPの励起/発光キューブ（AMG EVOS FL）と60X対物レンズを用いてスリップと画像。
4. 滅菌H ₂ Oを使用して1:10に体外培養における各100μlのアリコートを希釈1mMのIPTG及び6.25μg/ mlのcmおよび水で100μlAYEメディアを使用して空白にします。分光光度計を用いて希釈液のOD600測定（Bio-Rad社製スマートスペックプラス）を取る。 体外培養ごとにMOI = 20で十分に感染するボリュームが必要な計算V = [（アメーバシード）×MOIの] / [外径_600×（希釈係数）×（定数）] = [（1×10 ⁶ ）×（20）] / [OD _{600×（10）×（1×10} ^6）] = 2/OD _600。細菌の濃度をOD ₆₀₀ = 1.0 = 1×10 ⁹ CFU / mlであると判定される。

2。 カステラーニアメーバを用いたプライミング段階の感染

1. 維持し、RTで175cm ^2のフラスコで、ATCC 712 PYG培地でアメーバを栽培しています。
2. アメーバ文化でメディアを交換してくださいTuresの菌液の培養を開始する前に24時間。同日液細菌培養が開始され、血球計数器を用いて光学顕微鏡で細胞を回収し、カウント。
3. 1×10 ⁶細胞/ mlの最終濃度に新鮮な培地とアメーバを希釈します。 RT O / Nでリピートピペッター、インキュベートを用いたアメーバの1mlアリコートによるシード12ウェル細胞培養プレート
4. インキュベーション後、10ミリリットル血清ピペットおよび手動ピペット助剤を用いて1ミリリットル滅菌PBSで3回、12ウェル細胞培養プレートのウェルを洗う。
5. PBSを吸引後、1mMのIPTG、各ウェルに6.25μg/ mlのcmの感染媒体（ATCC 712 PYGメディアマイナスグルコース、ペプトン、酵母エキス）の1ミリリットルを追加します。室温で1時間プレートをインキュベートする。
6. MOI = 20でウェルを感染させる。 5分（エッペンドルフ5810R）、400 xgでプレートを遠心し、5分間37℃の水浴中で浮かんでいる。 37℃、18時間、5％CO ₂インキュベーターにプレートを転送します。
7. 細菌の細胞溶解と収穫をホストするために前に蛍光顕微鏡でライブセルイメージングを使用して感染を確認してください。

3。ターゲット細胞期感染のTHP-1細胞を播種

1. （従来の液体細菌培養をセットアップするためのこのプロセスを開始する24時間）。 10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI 1640培地でコンフルエントに近い75cm ^2の培養フラスコ中THP-1細胞を栽培しています。
2. 血球計数器を用いて懸濁細胞をカウントし、1×10 ⁶細胞/ mlの濃度に10％FBSおよび100 ng / mlのホルボール-12 -ミリステート13 -アセテート（PMA）を含むRPMI 1640培地でTHP-1細胞を希釈、12ウェル細胞培養プレート上に1mlアリコートのプレート。 37℃で48時間プレートをインキュベート℃、5％CO _2で 。

4。プライミング段階の感染後のターゲット細胞期感染症の細菌の処理

1. プライミングアメーバから培地を吸引。
2. 溶解するmoebaeは、室温で10分間氷冷滅菌超濾過（UF）、H ₂ Oとインキュベート500μlのを使用しています。
3. プールタイプを痛め、蛍光プレートリーダー（Molecular Devices SpectramaxジェミニEM）を使用して、プールされた溶解液の各々のためのE _{512 nmでの吸光度}測定を取るに従ってライセート。
4. - + 0.0019 calcOD ₆₀₀ = 0.0008（ライセート背景E _512）：プールされた溶解液のOD ₆₀₀測定値を計算します。式は、以前、OD ₆₀₀ と Lの希釈のE _{512 nmの}測定の両方の直接比較をグラフ化することにより決定された体外培養定常期（ 図1 *）からレジオネラ野生型GFPを発現。感染したアメーバと同じ実験条件に従う感染していないアメーバの溶解物を、ブランクとして使用し、式に組み込まれた補正値（ 例えばライセート背景）が設けられている。ボリュームに必要なトンの井戸を感染O MOI = 20が各溶解プールのために計算される：V = [（THP-1シード）×MOIの] / [calcOD _600×（定数）] = [（1×10 ^{6）×（20）]} / [calcOD _{600×（1×10} ^6）] = 20 / calcOD _600。
5. PBSで3倍のTHP-1細胞を洗浄し、各ウェルに1 mlの新鮮なRPMI 1640培地（10％FBS）を追加します。 37℃で1時間インキュベートしたTHP-1細胞℃、5％CO _2で 。
6. 計算されたMOIのプールされた溶解液を使用してでのTHP-1細胞を感染させる。井戸のセットは、フローサイトメトリー解析において、ネガティブコントロールとして、感染していないままにすることができます。プライミング段階の処理が30分未満で完了する必要があります。溶解物を感染前の細菌の遺伝子発現の変化を制限するために氷の上で保存されています。
7. プレートを遠心分離し、温度を上げるために、フロート、プライミング段階のように静置します。
8. 一時間後の感染症は、細胞外の細菌を除去し、PBSで3回洗浄し、吸引井戸でメディアを取り出してください。
9. 周波数1ミリリットルを追加shを含むRPMI井戸〜1640（10％FBS）およびインキュベーターにプレートを返す。すぐにメディアを交換した後の時間は時刻ゼロ（T _0）となっています。 37℃で14から16時間、THP-1細胞をインキュベート℃、5％CO _2で 。

5。実験解析

5.1ライブセルイメージング

画像10Xまたは20X倍率（ 図1A〜D）での蛍光顕微鏡（AMG EVOS FL）を使用して感染した井戸を。画像は、プライミング段階とターゲット細胞期感染の両方で感染のレベルを決定するためにどちらかの定性的または定量的に比較することができます。

5.2フローサイトメトリー

1. 別の感染症の発光ピークは、フローサイトメトリー（BD FACSソウルキャリバー）によって比較することができます。感染したTHP-1細胞をトリプシン処理し、静かにピペットでPBS中で混合することにより、井戸から洗い流してください。
2. 2用の1800×gで15mlファルコンチューブ、ペレットにプールひずみの種類別のセルをテーブルトップ遠心機で分。
3. 1mlのPBSでペレットを一時停止し、1.5 mlのマイクロチューブに移す。
4. 1800×gで（エッペンドルフ5424）と1 mlのPBSで再懸濁ペレットで懸濁液を遠心分離します。得られた懸濁液は混濁している場合（OD _600≥1.0）彼らは、フローサイトメーターのラインの目詰まりを防止するために、追加のPBS（1:3）で希釈しなければならない。
5. フローサイトメーターの平衡化とサンプル注入の間に洗浄ステップのための滅菌ろ過PBSを使用します。事前の標的細胞の感染サンプルの注入に感染していない標的細胞の前方/側方散乱をプロットします。
6. 488nmレーザー励起およびFL1チャネルを使用して、それぞれの条件の20,000合計イベントを収集します。
7. ゲートポストキャプチャ細胞集団は、非感染細胞とヒストグラムのプロット蛍光強度（FlowJo）（ 図1E）を除外することができます。

5.3 CFUメッキ

1. 効率oを調べるフローサイトメトリーのために採取された細胞のCFUめっきによるfの感染。超濾過され、H ₂ 10 ^-1のO、10 ^{-2、10 -3}でサンプルの希釈系列を調製します。
2. 6.25μg/ mlのCMと各希釈CYEAプレートの1月3日の上のプレートを20μl。
3. 72時間37℃でプレートをインキュベートする。
4. つまようじとセルカウンターを用いてコロニーをカウントします。

結果

全体の感染過程の典型的な結果を図1に概説されています。野生型L.に感染A.castellaniiの単層を描いた細胞の蛍光顕微鏡写真を生きるプライミング·ステージ中にニューモを 図1Aに示されています。プライミング工程の成功の尺度はこのMOIでのGFP標識した細菌が取り込ま大型の液胞を含有する宿主細胞の約90％の人口につながるであろう。 18時間感染?...

ディスカッション

細菌の遺伝子発現はしっかりライフサイクルの進行や周囲の微小環境内の信号への応答の組み合わせを介して制御されます。そのようなLと空胞変性病原体ファゴソームで仕切ら時ニューモは宿主細胞由来の手がかりの多くに対応しています。宿主細胞内の栄養素の枯渇の集団結果、細菌は、その後の宿主細胞は^25〜成功普及するために必要な因子を発現させることによ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	antibiotic
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
ACES	Sigma	A9758-1KG	media component
ATCC medium: 712 PYG	ATCC		growth media for protozoans
1X PBS	Fisher Scientific	SH30256FS	phosphate buffered saline
activated charcoal	Fisher Scientific	C272-212	media component
yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	media component
peptone	BD Diagnostics	211677	media component
agar	Fisher Scientific	BP1423-2	media component
L-cysteine, 99%+	Acros organics	173601000	media supplement
Ferric nitrate nonahydrate	Fisher Scientific	I110-100	media supplement
Equipment
EVOS fl	AMG	EVOS fl	fluorescence microscope
Smart Spec Plus	Bio-Rad	170-2525	spectrophotometer
5810 R centrifuge	Eppendorf	22627023	bench top centrifuge
Repeater plus	Eppendorf	22230201	repeating pipette
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices		microplate reader
Softmax Pro 5.3	Molecular Devices	0200-310	microplate reader software
5424 microfuge	Eppendorf	22620401	table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II	Scienceware	379111010	pipette aid
FACS Calibur	BD Bioscience		flow cytometer
FlowJo 7.6.1	FlowJo	license	flow cytometery software
15 ml tube	BD Falcon	352096	polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube	Neptune	3745.X	microcentrifuge tubes