从人类多能干细胞的规范在前脑谷氨酸能神经元

摘要

此过程产生在前脑的​​神经元通过检查站，这是人类发展过程中所观察到的类似。细胞可自发地分化，暴露因素推动对神经系，是孤立的，并镀上盖玻片，以便终末分化和成熟。

摘要

这里，已经描述了用于高效地生成从人多能性干细胞（PSCs）端脑谷氨酸能神经元的一个逐步的过程。的分化过程开始向上舍入到时形成聚集体的悬浮培养细胞被放置在成团块通过打破人类安全公司。聚集在人类胚胎干细胞培养基中生长1-4天，以允许自发分化。在这段时间内，将细胞有能力成为任何三种胚层。从5-8天，将细胞放置在一个神经诱导培养基中，推入神经谱系。第8天左右，细胞被允许连接到6孔板上，并分化期间的时间的神经上皮细胞形式。这些神经上皮细胞，可以隔离17天。这些细胞可以保持神经球，直到他们准备好盖玻片的培养皿上。使用碱性介质中没有任何caudalizing因素，神经上皮细胞specifieD插入端脑前体，然后可以进一步区分有效地背端脑祖细胞和谷氨酸能神经元的。总的来说，我们的系统提供了一个工具来生成人体谷氨酸能神经元的研究人员研究这些神经元疾病，影响到他们的发展。

引言

人多能性干细胞（PSCs），包括人类胚胎干细胞（胚胎干细胞），诱导式多能性干细胞（iPS细胞），具有的能力，以产生在体内的每一个细胞类型，包括神经元^1-3。定向分化为各种神经元亚型人分成合同持有这些细胞在再生医学中的应用的关键。在开发过程中的功能神经元亚型的产生是一个复杂的过程，涉及诱导的神经系的区域沿rostro尾鳍轴祖细胞，该规范，并从区域^4,5祖细胞的有丝分裂后的神经元类型的分化。从2001年开始，一些系统已建立了从人类胚胎干细胞，它提供了一个平台，为后续神经元亚型^6,7代产生神经系。根据发展原则，一些神经元类型，如^8-12脊髓运动神经元，脑DOP^{13日至15日} ，胺类神经元和神经视网膜细胞^16,17已有效地从人的产品分成合同中指定。这样做是通过施加临界形态发生素体内发育过程中的规格，这些神经元类型是重要的。其他协议也得到了发展，促进人类胚胎干细胞分化成神经元可以使用其他的因素，如小分子或与其他类型的细胞共培养，以^18-20帮助促进花芽分化^21。

人类的大脑新皮质是高度发达的，包含许多类型的细胞，包括谷氨酸能神经元在学习，记忆和认知功能的^22,23，其中扮演了重要的角色。产生谷氨酸能神经元在培养的第一个步骤是指定端脑的祖细胞。笹井芳树的组首次报道了端脑前体定向分化的小鼠胚胎干细胞（mESCs）使用无血清悬索桥的N培养物的存在下，DKK1（抑制Wnt信号）以及LeftyA（抑制节点信令^）24。随后，几个研究小组还报告了包括我们在内的人类在无血清培养基^{25日至27日的}物业服务端脑前体的规范。并不需要外源的形态发生和效率产生这些前体的使用是远高于从mESCs ^26,27的端脑前体从人类安全公司代。在这里，神经诱导，以及设立的张的基⁷的化学定义的系统已被描述。此协议没有此外外源性caudalizing因素，有效地产生端脑前体从人类安全公司^27。通过调节Wnt信号和Sonic Hedgehog（SHH）的信令，这些祖细胞可以分化成背侧或腹侧祖细胞，，背祖细胞进一步分化成谷氨酸能神经元Ëfficiently ^27。此外，该协议还可以很好地用于谷氨酸能神经元的产生，从人类iPSCs ^28，这允许针对具体患者的神经元的产生，可以利用机制的探索行动，以及潜在的治疗疾病的大型阵列。此外，我们的系统还提供了一个平台，探索不同的前脑的神经元类型的发展和规范。

研究方案

1。代的人类多能干细胞聚集体（D1-D4）

1. 人类多能干细胞对小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的送料器，在胚胎干细胞的存在下与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，4纳克/毫升）的培养基中培养。经过5-7天的培养时，菌落大，但仍然未分化的，他们是为下一步做好准备。
2. 应先来制备的酶溶液。在一个50毫升的试管中，溶解在1毫克/毫升的浓度成DMEM/F12培养基分散酶（或胶原酶）。由于这些解决方案，混合最好的，受热后，将管中介质和酶，37℃水浴10-15分钟，然后它使用Steriflip过滤器进行消毒。
3. 吸介质的细胞，将其冲洗DMEM/F12，并吸取这一关。 3-5分钟为胚胎干细胞（iPS细胞）最多10分钟，加入1毫升分离酶在孵化器中的各孔和地点。的细胞在显微镜下看;边缘微微蜷缩/看起来有点暗，细胞，为下一步做好准备。最好是，检查细胞后3分钟，如有必要，将它们放回。当首次使用此协议，它是最好的开始与在同一时间只有一个板的细胞，因为它重要的是尽可能快地从分离酶以除去细胞。
4. 吸液从细胞中分离酶。轻轻地（在这个阶段的细胞是非常脆弱的，并会在板相对容易）加入1.5毫升的DMEM/F12培养基，每孔以冲洗掉分离酶。吸液DMEM/F12和1.5毫升的人类胚胎干细胞培养基添加到各孔中。
5. 要分离，打破了细胞，将10毫升的玻璃吸管的尖端对右下角的良好（触摸细胞）和向上移液管和上下（垂直） - 向上的行程应该是在接近该法律程序的向下行程。一旦达到的井，另一侧，重复在水平可怕ction。
6. 一旦所有的细胞是在悬浮液中，将它们放置在15ml试管中，并在200×g离心2分钟离心。应该有一个细胞在试管底部沉淀。吸液介质从上面的粒料。
7. 应当被用来保持中的聚集体的细胞培养烧瓶中的大小取决于原始细胞的数量。 6口井（板）的胚胎干细胞，组织培养处理的T75烧瓶，用50毫升的人类胚胎干细胞培养基中应使用。从步骤1.6将细胞转移到烧瓶中并孵育在37℃下
8. 为了摆脱的细胞碎片，细胞培养基和烧瓶中约12小时后，应更换。要做到这一点，将所有的介质/细胞到一个50毫升的试管中，向下旋转的细胞（200×g离心2分钟），并吸移的旧培养基。接下来，加50毫升的新鲜胚胎干细胞培养基中的细胞，并放置到一个新的T75烧瓶。跟随此相同的方法（直到第5天），然后，这些细胞可以每天供给。

2。诱导神经上皮细胞（D5-D17）

1. 细胞/培养基转移到一个50毫升的试管中，离心细胞，以200×g的2分钟。接着，抽吸除去上清液，将细胞转移到一个新的（非组织培养处理）的T75烧瓶中的神经诱导培养基（NIM）用50ml。
2. 一旦细胞在NIM，有一半的介质应更换每一天。应该变得足够大，以在那里他们将下沉到自己的50毫升锥形管的底部，几分钟后（没有离心）的聚集体。经过2-3天NIM（D7-D8总），细胞板的准备。层粘连蛋白或牛胎儿血清（FBS），可以被用来帮助细胞附着到板。
3. 组织培养处理的数量取决于所需要的6孔板中的细胞密度为每个聚合应该是能够生长在平板上的多个天，而不会接触任何其他。平均来说，从一个细胞T75烧瓶，将产生约4-6 6孔板价值的细胞。
4. 1. 如果使用的层粘连蛋白，它在NIM稀释至10-20μg/ ml到涂覆的6孔板中（〜0.5毫升/孔）。涂布后的2-3小时，板到6孔板中（〜20-30的总量每孔）的细胞聚集。后聚集附加，添加1.5毫升的NIM。
   2. 如果使用FBS，制备90％的NIM和10％FBS（1.5毫升/孔）的混合物。的细胞，每孔加入1.5毫升中，轻轻摇动板来回传播的聚集，使细胞附着在孵化器的O / N。第二天早上一定要改变介质（2毫升/ NIM）删除FBS。
5. 经过一两天的电镀，每个聚集会蔓延到形成单分子膜。中心在一两天内，这些细胞形态出现类似的柱状细胞（拉长）。在此期间，改变NIM每一天。有些PSC线（尤其是LY IPSC），可能会形成柱状细胞的效率较低。如果发生这种情况，除了在第2阶段的BMP和TGF的抑制剂（Dorsomorphin ^{29，2μMSB431542 19），}的能有所帮助。
6. 大约14-17天，柱状细胞会出现更加紧凑。有时，这些细胞形成，可见肠腔内的隆起或环。除了 ​​柱状形态，在此阶段的细胞表达神经上皮的标记物，如PAX6和SOX1 ^12,26。
7. 的隔离就可以开始之前，必须先检查，以确定是否有任何非神经上皮细胞的细胞。可以利用的客观指标，以指示非神经上皮菌落。然后可以消除刮了一套吸头。

3。在前脑祖细胞的生成（D17-D24）

1. 菌落的中心包含神经上皮细胞，和应分离的集落的其余部分的。这是可以做到使用微管和过滤，无菌1毫升移液枪枪头。当少量的压力被施加到的菌落的中央部，它通常很容易地升空。要小心不要让外部分的殖民地脱离。如果中心固执，不会脱落在他们自己的，他们可以被删除，他们在无菌罩在显微镜下用针切除。转移到一个15毫升的试管的菌落的中心部，和自旋在200×g离心2分钟。
2. 介质应该吸气的细胞。两个板价值的细胞可以被转移到一个非组织培养处理的T25烧瓶中含有10毫升的NIM与B27的添加（不包括维生素A，1:50）。使用5-10毫升培养基，每一个板的细胞。
3. 当细胞被查看过翌日，他们应该有一个球体状外观。这些细胞转移到一个新的烧瓶中（在存在的NIM和B27，1:50）是必要的，因为它往往是周边小区忙里偷闲，附着在烧瓶的底部。
4. 然后悬浮培养的神经球一个星期用NIM补充B27（1:50）。为了促进细胞的耐力和增殖，环AMP（cAMP，1μM）以及胰岛素生长因子（IGF-1，10毫微克/毫升），可以添加到培养基中悬浮培养过程中。此时，神经球包含在前脑祖细胞（FOXG1 ^+）和准备终末分化的盖玻片的培养皿上。

4。进一步分化为大脑（D25 +）

1. 1. 准备的poly-ornithine/laminin涂布盖玻片（24孔板），电镀细胞。盖玻片首先清除，然后，涂覆有伎俩-鸟氨酸（0.1毫克/毫升，37℃下，O / N，并储存在冷冻机）。
      聚鸟氨酸涂层：
      1. 消毒盖玻片：在将盖玻片烧杯中含有硝酸，并轻轻摇动的通风柜中一小时。下运行至少15分钟，去离子水，倒出来的硝酸，用去离子水冲洗几次，并留下盖玻片。放置在95％乙醇和盖玻片要么振摇30分钟（立即如果使用），或存储在乙醇中，在RT。
      2. 在无菌罩中，倒入含有灭菌盖玻片的6孔​​板中的盖的50ml管中的内容。用灭菌镊子，拿起一个盖玻片的时间，并设置在一个单一的24孔板直立。如此重复，各孔有盖玻片。
      3. 他们完全干燥后，请点选板，直到的盖玻片已经落空，每孔。下一步加入100μl聚鸟氨酸（0.1毫克/毫升的无菌蒸馏水_{2 O），}每个盖玻片和孵化板O / N，37°C。
      4. 第二天，取出板从培养箱中，并让他们冷却至室温。吸液聚-鸟氨酸每个盖玻片（从边缘吨他盖玻片）确保在这个过程中不要触摸或划伤盖玻片。允许盖玻片洗涤前干燥约30分钟。
      5. 加入1毫升无菌蒸馏水_{2 O，}每孔，让我们坐了10分钟，从每口井的水吸出。重复清洗步骤两次。后板完全干燥，（休假覆盖在引擎盖）将盖子上，盖上铝箔，并储存在-20°C
   2. 1. 与层粘连蛋白涂覆盖玻片，神经分化培养基和层粘连蛋白（终浓度为20微克/毫升）的混合物中加入50μl的每个聚-鸟氨酸处理盖玻片小心只有触摸盖玻片本身（的液体和不漏关闭）。在37°C孵育1-2小时，然后准备附件的细胞。
2. 收集和神经球在200 XG离心2分钟在15毫升的试管。吸液上清液。
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1. 冲洗DMEM-F12细胞的细胞再次离心。如果神经球太大正确附加，它们可以是在此步骤中与Accutase分离。
2. 如果使用Accutase：洗涤后的细胞用DMEM-F12中，神经球解离的通过添加Accutase（〜2毫升）和3分钟，在37℃下孵育细胞的小簇。接下来，添加相同量的胰蛋白酶抑制剂（〜2毫升）和离心处理，以使细胞在200×g离心3分钟。然后，将细胞重新悬浮在NDM破碎使用P200的吸移管。小群，然后镀上预包被的盖玻片。
3. 吸干关闭大多数的培养基中，并将其放置到6厘米的陪替氏培养皿上的细胞在介质上，以便选择它们变得更容易几滴的。新增约4-5神经球到每个预包被的盖玻片。有没有必要第一吸入关闭的层粘连蛋白。
4. 让我们的神经球贴壁至少2-4小时。一旦他们有了一个ttached，更介质（0.5毫升/盖玻片）应予以补充。它应该包括有B27（1:50）的神经分化培养基中，cAMP（1μM），和神经营养因子（BDNF，GDNF，和胰岛素样生长因子，所有在10纳克/毫升）。此时介质的一半可以隔日更换，这些细胞可以维持数月。

结果

在这里，一个协议来区分人类安全公司到端脑谷氨酸能神经元通过几个关键步骤：PSC的聚集体的形成，神经上皮细胞的诱导，在前脑祖细胞的生成，这些祖细胞的终末分化的成端脑的神经元（ 图1）具有被描述。此系统是稳健的和有效率的，在端脑祖细胞和谷氨酸能神经元的生成。作为一个例子（ 图2），未经此外caudalizing因素，胚胎干细胞分化为神经系^27。在24天...

讨论

在神经细胞分化过程中有几个关键的步骤。重要的是要确保人的产品分成合同，因为否则的细胞是多能干细胞，可能已经偏向成为非神经元谱系。这可以通过以下的确认染色与多能性的标记物，如即Oct4，Sox2基因，Nanog基因，和的Tra-1-60 ^1-3的抗人类安全公司。如果人类安全公司不重视很好后传代，ROCK抑制剂（Y27632）可以被添加到帮助。对于那些有困难，保持其细胞多能性，一些潜在的问题...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)	Gibco	11330-032
Knockout Serum Replacer	Gibco	10828-028
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Non Essential Amino Acids	Gibco	1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M)	Sigma	M-7522
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
N2	Gibco	17502-048
B27	Gibco	12587-010
Heparin	Sigma	H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)	Sigma	116K5103
Laminin (human)	Sigma	L-6274
Laminin (mouse)	Invitrogen	23017-015
FBS	Gemini	100-106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A-7906
Dispase	Gibco	17105-041
Collagenase	Invitrogen	17104-019
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
ROCK Inhibitor	Stemgent	04-0012
SB431542	Stemgent	04-0010
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)	Invitrogen	13256-029
Trypsin inhibitor	Gibco	17075
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
Foxg1 antibody	Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50)	Developmental Studies Hybridoma Bank	I12
Pax6 antibody (1:5000)	Developmental Studies Hybridoma Bank	PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200)	Chemicon	MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000)	Chemicon	AB9616
vGLUT1 antibody (1:100)	Synaptic Systems	135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)	PrepoTech Inc.	450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF)	PrepoTech Inc.	450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1)	PrepoTech Inc.	100-11
Cyclic AMP (cAMP)	Sigma	D-0260
Sonic hedgehog (SHH)	R&D	1845-SH
50 ml tubes	Becton Dickinson (BD)	352098
15 ml tubes	BD	352097
6 well plates	BD	353046
24 well plates	BD	353047
T25 flasks (untreated)	BD	353009
T75 flasks (untreated)	BD	353133
Coverslips	Chemiglass Life Sciences	1760-012
6 cm Petri dishes	BD	353004
9'' glass pipetes	Fisher	13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM)	Millipore	SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM)	Millipore	SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1)	Zeiss	R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)	Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance)	The Baker Company
Centrifuge (5702 R)	Eppendorf