La especificación de telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes

Resumen

Este procedimiento produce neuronas telencefálicas pasando a través de los puntos de control que son similares a los observados durante el desarrollo humano. Las células se dejan a diferenciarse espontáneamente, están expuestas a factores que los empujan hacia el linaje neural, están aislados, y se sembraron sobre cubreobjetos para permitir la diferenciación terminal y la maduración.

Resumen

Aquí, un procedimiento por etapas para generar eficientemente telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes (PSC) se ha descrito. El proceso de diferenciación se inicia rompiendo las PSCs humanos en terrones que redondear hacia arriba hasta formar agregados cuando las células se colocan en un cultivo en suspensión. Los agregados se hacen crecer entonces en un medio de hESC 1-4 días para permitir la diferenciación espontánea. Durante este tiempo, las células tienen la capacidad de convertirse en cualquiera de las tres capas germinales. De día 5-8, las células se colocan en un medio de inducción neural para empujarlos en el linaje neural. Alrededor de 8 días, las células se dejan adherir a placas de 6 pocillos y se diferencian durante el cual la forma células neuroepiteliales. Estas células neuroepiteliales se puede aislar a día 17. Las células entonces se puede mantener como neuroesferas hasta que estén listos para ser chapada en cubreobjetos. El uso de un medio básico sin ningún factor de caudalizing, células neuroepiteliales son specified en los precursores telencefálicas, que luego pueden diferenciarse también en dorsal progenitores telencefálicas y neuronas glutamatérgicas eficiente. En general, nuestro sistema proporciona una herramienta para generar neuronas glutamatérgicas humanos para los investigadores para estudiar el desarrollo de estas neuronas y las enfermedades que les afectan.

Introducción

Las células madre pluripotentes (PSC), incluyendo tanto las células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (iPS), tienen la capacidad de generar cualquier tipo de célula en el cuerpo, incluyendo las neuronas ^1-3. Diferenciación dirigida de diversos subtipos neuronales de los CRP humanos es la clave para la aplicación de estas células en la medicina regenerativa. La generación de funcionales subtipos neuronales durante el desarrollo es un proceso complejo que implica la inducción de linaje neuronal, la especificación de los progenitores regionales a lo largo del eje rostro-caudal, y la diferenciación de tipos de neuronas post-mitóticas de los progenitores ^4,5 regionales. A partir de 2001, varios sistemas se han establecido para generar linaje neural de hESCs, que han proporcionado una plataforma para la posterior generación de subtipos neuronales ^6,7. Sobre la base de los principios de desarrollo, varios tipos de neuronas, como las neuronas espinales motor ^8-12, mesencéfalo dopneuronas aminérgicos ^13-15, y células de la retina neural ^16,17 se han especificado de manera eficiente PSCs humanas. Esto se realizó mediante la aplicación de morfógenos críticos que son importantes para la especificación de estos tipos de neuronas durante el desarrollo in vivo. Otros protocolos también se han desarrollado para promover la diferenciación de hESCs en neuronas usando cualquiera de los factores adicionales ^18-20, tales como pequeñas moléculas o mediante el cultivo conjunto con otros tipos de células para ayudar a promover la diferenciación ^21.

El neocórtex humano está muy desarrollado y contiene muchos tipos de células, incluidas las neuronas glutamatérgicas que desempeñan un papel importante en el aprendizaje, la memoria y la función cognitiva ^22,23. El primer paso en la generación de neuronas glutamatérgicas en cultivo es para especificar células progenitoras telencefálicas. Yoshiki Sasai del grupo por primera vez la diferenciación dirigida de precursores telencefálicas de ratón CES (mESCs) utilizando una suspensio libre de sueron cultivo en presencia de DKK1 (que inhibe la señalización de Wnt), así como LeftyA (que inhibe la señalización nodal) ^24. Posteriormente, varios grupos incluyendo el nuestro también han informado de la especificación de precursores telencefálicas de PSCs humanos en suero libre de mediano ^25-27. La generación de los precursores de los CRP humanos telencefálicas no requiere el uso de morfógenos exógenas y la eficiencia en la generación de estos precursores es mucho mayor que la de mESCs ^26,27. Aquí, un sistema químicamente definido para la inducción neural que estaba bien establecida por el grupo de Zhang ⁷ se ha descrito. Sin la adición de factores exógenos caudalizing, este protocolo eficiente genera precursores telencefálicas de PSCs humanos ^27. Estos progenitores entonces se pueden diferenciar en progenitores dorsal o ventral mediante la regulación de la señalización de Wnt y sonic hedgehog (SHH). Las células progenitoras más dorsales pueden diferenciarse en neuronas e glutamatérgicafficiently ^27. Además, este protocolo también funciona bien para la generación de neuronas glutamatérgicas de humano iPSCs ^28, que permite la generación de pacientes específicos de neuronas que se pueden utilizar para estudiar el mecanismo de acción, así como terapias potenciales para una gran variedad de enfermedades . Por otra parte, nuestro sistema también proporciona una plataforma para explorar el desarrollo y la especificación de los diversos tipos neuronales en el telencéfalo.

Protocolo

1. Generación de agregados humanos de células madre pluripotentes (D1-D4)

1. Las células madre pluripotentes se cultivan en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) alimentadores en presencia de medio suplementado con hESC factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, 4 ng / ml). Después de 5-7 días en cultivo, cuando las colonias son grandes, pero todavía no diferenciado, que están listos para el siguiente paso.
2. La primera solución enzimática debe estar preparado. En un tubo de 50 ml, se disuelve el dispasa (o colagenasa) a 1 mg / ml de concentración en medio DMEM/F12. Ya que estas soluciones mezclar mejor cuando se calienta, se coloca el tubo que contiene el medio y la enzima en un baño a 37 ° C durante 10-15 min y después esterilizar utilizando un filtro de Steriflip.
3. Aspirar fuera el medio de las células, enjuáguelos con DMEM/F12, y aspirar esto fuera así. Añadir 1 ml de dispasa a cada pocillo y colocar en la incubadora durante 3-5 min para hESCs (hasta 10 min para iPSCs). Mira las células bajo el microscopio, cuandolos bordes se doblen ligeramente hacia arriba / mirar un poco más oscuro, las células están listos para el siguiente paso. Lo mejor es comprobar que las células después de 3 min y ponerlos de nuevo en caso necesario. Cuando se utiliza este protocolo para la primera vez, es mejor empezar con una sola placa de células en un momento, ya que es importante para eliminar las células de la dispasa lo más rápidamente posible.
4. Aspirar fuera de la dispasa de las células. Suavemente (las células son muy vulnerables en esta etapa y se desprenderá de la placa con relativa facilidad) añadir 1,5 ml de DMEM/F12 medio a cada pocillo para enjuagar el dispasa. Aspirar fuera de la DMEM/F12 y añadir 1,5 ml de medio de células madre a cada pocillo.
5. Para separar y romper las células, coloque la punta de una pipeta de vidrio de 10 ml hacia la esquina inferior derecha de un pozo (tocando las células) y pasar la pipeta hacia arriba y hacia abajo (verticalmente) - la cámara de calderas debe estar hacia arriba en las proximidades a la carrera hacia abajo procedimiento. Una vez que el otro lado de la bien se alcanza, repetir en la horizontal extremacción.
6. Una vez que todas las células están en suspensión, colocarlos en tubos de 15 ml y centrifugar de ellos a 200 xg durante 2 min. Debe haber un pellet de células en la parte inferior del tubo. Aspirar el medio de apagado desde encima de la pastilla.
7. El tamaño del matraz de cultivo de células que se deben utilizar para mantener los agregados en depende de la cantidad original de células. Para 6 pozos (1 placa) de hESCs, uno no tejido tratadas con cultivo matraz T75 con 50 ml de medio de células madre debe ser utilizado. Transferir las células a partir del paso 1,6 en el matraz y se incuba a 37 ° C.
8. Con el fin de deshacerse de los desechos de células, el medio celular y el frasco debe ser reemplazado aproximadamente 12 horas más tarde. Para ello, coloque todos los medios / células en un tubo de 50 ml, girar las celdas hacia abajo (200 xg durante 2 min), y aspirar el medio de edad. A continuación, añadir 50 ml de medio fresco a las células madre, las células y el lugar en un nuevo frasco T75. Las células pueden ser alimentados diariamente siguiendo este mismo procedimiento (hasta el día 5).

2. La inducción de células neuroepiteliales (D5-D17)

1. Transferir las células / medio a un tubo de 50 ml y centrifugar las células durante 2 minutos a 200 x g. A continuación, aspirar el sobrenadante, y transferir las células a una nueva (no tratadas con cultivo de tejido) matraz T75 con 50 ml de medio de inducción neural (NIM).
2. Una vez que las células están en NIM, la mitad del medio se sustituye cada dos días. Los agregados deben ser lo suficientemente grande para donde se hunden hasta el fondo de un tubo cónico de 50 ml por sí solos después de unos minutos (sin centrifugación necesario). Después de 2-3 días en NIM (D7-D8 total), las células deben estar listos para la placa. La laminina o de suero fetal bovino (FBS) puede ser utilizado para ayudar a las células se unen a las placas.
3. El número de cultivo de tejidos tratados placas de 6 pocillos que se necesitan depende de la densidad de las células en cada agregado debe ser capaz de crecer en la placa durante varios días más sin tocar ninguno de los otros. Por término medio, las células de unT75 frasco producirá alrededor de 4-6 placas de 6 pocillos valor de las células.
4. 1. Si se utiliza la laminina, diluirlo en NIM a 10-20 g / ml para recubrir el 6-así placa (~ 0,5 ml / pocillo). Después del recubrimiento durante 2-3 h, agregados de células en placas de 6 pocillos (~ 20-30 agregados por pocillo). Después de que los agregados han unido, añadir 1,5 ml de NIM.
   2. Si se utiliza FBS, preparar una mezcla de 90% NIM y FBS 10% (1,5 ml / pocillo). Añadir 1,5 ml de medio con las células a cada pocillo, agitar suavemente la placa de un lado a otro para esparcir los agregados, y permitir que las células se unan O / N en una incubadora. Asegúrese de cambiar el medio (2 ml / pocillo de NIM) a la mañana siguiente para quitar el FBS.
5. Después de un día o dos de ser chapado, cada agregado se extiende para formar una monocapa. Dentro de un par de días, los centros de la mayoría de estas células morfológicamente tendrá un aspecto similar a las células columnares (alargada). Durante este período, el NIM cambiar cada dos días. Algunas líneas PSC (especially IPSC), pueden formar células columnares con menos eficiencia. Si esto sucede, la adición de BMP y TGF inhibidores (Dorsomorphin ^29, SB431542 ¹⁹ a 2 mM) durante la etapa 2 puede ser útil.
6. Alrededor de los días 14-17, las células columnares aparecerá más compacto. A veces, estas células forman crestas o anillos visibles con luz interior. Además de la morfología columnar, las células en esta etapa expresan marcadores neuroepiteliales, tales como PAX6 y ^12,26 SOX1.
7. Antes de que el aislamiento puede comenzar, uno primero debe examinar las células para determinar si hay células presentes no neuroepiteliales. Un marcador de objetivo puede ser utilizada para indicar las colonias no neuroepiteliales. Estos pueden ser eliminados al quitarlas con una punta de pipeta.

3. Generación de Progenitores telencefálicas (D17-D24)

1. Los centros de las colonias contienen las células neuroepiteliales, y deben ser aislados del resto de la colonia. Esto se puede hacer utilizandouna micropipeta estéril y 1 ml de filtrado punta de la pipeta. Cuando una pequeña cantidad de presión se aplica a la porción central de la colonia, que generalmente se levanta con bastante facilidad. Tener la precaución de no dejar que la porción exterior de la colonia separar también. Si los centros están siendo terco y no se caen por sí solos, pueden ser removidos por escisión de ellos con una aguja en un microscopio en una campana estéril. Transferir las partes centrales de las colonias a un tubo de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 2 min.
2. El medio debe ser aspirado fuera de las células. Dos placas de células valor puede ser transferido a una cultura no-tejido tratado T25 matraz que contenía 10 ml de NIM con la adición de B27 (sin vitamina A, 1:50). Use 5-10 ml de medio por una placa de células.
3. Cuando las células se vieron el día siguiente, deben tener una esfera, como la apariencia. Es necesario transferir estas células en un matraz de nuevo (en la presencia de NIM y B27 1:50,), ya que es a menudo las células periféricasque colarse y se adhieren a la parte inferior de la botella.
4. El neuroesferas entonces deben cultivarse en suspensión durante una semana utilizando NIM suplementado con B27 (1:50). Con el fin de promover la resistencia y la proliferación celular, el AMP cíclico (AMPc, 1 mM), así como factor de crecimiento de insulina (IGF1, 10 ng / ml) puede ser añadido en el medio durante el cultivo en suspensión. En este punto, las neuroesferas contienen progenitores telencefálicas FOXG1 ⁽⁺⁾ y están listos para ser chapada en cubreobjetos para la diferenciación terminal.

4. Una mayor diferenciación en las neuronas telencefálicas (D25 +)

1. 1. Preparar los cubreobjetos recubiertos poly-ornithine/laminin (en placas de 24 pocillos) para placas las células. Los cubreobjetos se limpian primero, y se revisten entonces con estratagema-ornitina (a 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, y se almacenan en el congelador).
      Poly-ornitina revestimiento:
      1. Esterilizar los cubreobjetos: Coloca el cubreobjetos en unavaso de precipitados que contiene ácido nítrico y agitar suavemente en la campana de humos durante una hora. Vierta el ácido nítrico, enjuagar varias veces con agua desionizada, y dejar los cubreobjetos bajo el chorro de agua desionizada durante al menos 15 min. Colocar el cubreobjetos en 95% de etanol y, o bien agitar durante 30 min (si se utiliza inmediatamente) o tienda en etanol a RT.
      2. En una campana estéril, verter el contenido del tubo de 50 ml que contiene cubreobjetos esterilizados en la tapa de una placa de 6-así. Con unas pinzas esterilizadas, recoger un cubreobjetos a la vez y fijar en posición vertical en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos. Repetir de manera que cada pocillo tiene un cubreobjetos.
      3. Después de que se seque por completo, toque las placas hasta cubreobjetos han caído plana en cada pocillo. Siguiente añadir 100 ml de poli-ornitina (0,1 mg / ml en agua estéril dH ₂ O) a cada cubreobjetos e incubar las placas de O / N a 37 ° C.
      4. El día siguiente, retirar las placas de la incubadora y dejar que se enfríe a temperatura ambiente. Aspirar poli-ornitina fuera de cada cubreobjetos (desde el borde de tél cubreobjetos), asegurándose de no tocar ni rayar los cubreobjetos en el proceso. Permitir que los cubreobjetos se seque durante aproximadamente 30 min antes de lavar.
      5. Añadir 1 ml estéril dH ₂ O a cada pocillo, dejar reposar durante 10 min, y se aspira el agua de cada pocillo. Repita este paso de lavado dos veces más. Después de que las placas se seque por completo, (licencia cubre fuera de la campana) colocar las tapas, cubra con papel de aluminio, y se almacena a -20 ° C.
   2. 1. Para recubrir los cubreobjetos con laminina, añadir 50 l de una mezcla de medio de diferenciación neural y laminina (concentración final de 20 mg / ml) a cada cubreobjetos de poli-ornitina tratados con cuidado de tener sólo el líquido tocar la propia cubreobjetos (y no derramar off). Incubar ellos a 37 ° C durante 1-2 horas antes de preparar las células para la unión.
2. Recoger y centrifugar las neuroesferas a 200 xg durante 2 min en un tubo de 15 ml. Aspirar el sobrenadante.
3. 1. Enjuagar las células con DMEM-F12 y centrifugar las células de nuevo. Si las neuroesferas son demasiado grandes para fijar correctamente, pueden ser disociados con Accutase en este paso.
   2. Si se utiliza Accutase: Después de lavar las células con DMEM-F12, las neuroesferas se disocian a pequeños grupos mediante la adición de Accutase (~ 2 ml) e incubando las células a 37 ° C durante 3 min. A continuación, añadir la misma cantidad de inhibidor de tripsina (~ 2 ml) y centrifugar las células a 200 xg durante 3 min. Las células entonces se resuspendieron en NDM y rompe utilizando una pipeta P200. Las agrupaciones pequeñas se pueden pre-chapada en cubreobjetos recubiertos.
4. Aspirar fuera de la mayoría del medio y colocar las células en una placa de Petri de 6 cm en unas gotas de medio de manera que la selección de ellos se hace más fácil. Añadir aproximadamente 4-5 neuroesferas a cada cubreobjetos pre-revestido. No hay necesidad para aspirar fuera de la laminina primero.
5. Que el neuroesferas adjuntar por lo menos 2-4 horas. Una vez que tienen unattached bien, más a medio (0,5 ml / cubreobjeto) debe ser agregada. Se debe consistir en medio de diferenciación neural complementado con B27 (1:50), cAMP (1 mM), y factores neurotróficos (BDNF, GDNF, y el IGF, todo a 10 ng / ml). En este punto, la mitad del medio puede ser cambiado cada dos días y estas células se pueden mantener durante varios meses.

Resultados

Aquí, un protocolo para diferenciar los CRP humanos en telencefálicas neuronas glutamatérgicas a través de varios pasos críticos: la formación de agregados PSC, la inducción de células neuroepiteliales, la generación de los progenitores telencefálicas, y la diferenciación terminal de estos progenitores en neuronas telencefálicas (Figura 1) tiene han descrito. Este sistema es robusto y eficiente en la generación de los progenitores y neuronas glutamatérgicas telencefálicas. Como un ejemplo...

Discusión

Hay varios pasos críticos durante el proceso de diferenciación neural. Es importante asegurarse de que los PSCs humanas son pluripotentes, porque de lo contrario las células que ya pueden estar sesgados hacia convertirse en un linaje no neuronal. Esto se puede confirmar mediante tinción de las PSCs humanos con anticuerpos contra marcadores de pluripotencia, tales como Oct4, Sox2, Nanog, y ^1-3 Tra-1-60. Si los CPs humanos no se adhieren muy bien después de pases ellos, inhibidor de ROCK (Y27632) se puede ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)	Gibco	11330-032
Knockout Serum Replacer	Gibco	10828-028
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Non Essential Amino Acids	Gibco	1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M)	Sigma	M-7522
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
N2	Gibco	17502-048
B27	Gibco	12587-010
Heparin	Sigma	H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)	Sigma	116K5103
Laminin (human)	Sigma	L-6274
Laminin (mouse)	Invitrogen	23017-015
FBS	Gemini	100-106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A-7906
Dispase	Gibco	17105-041
Collagenase	Invitrogen	17104-019
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
ROCK Inhibitor	Stemgent	04-0012
SB431542	Stemgent	04-0010
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)	Invitrogen	13256-029
Trypsin inhibitor	Gibco	17075
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
Foxg1 antibody	Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50)	Developmental Studies Hybridoma Bank	I12
Pax6 antibody (1:5000)	Developmental Studies Hybridoma Bank	PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200)	Chemicon	MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000)	Chemicon	AB9616
vGLUT1 antibody (1:100)	Synaptic Systems	135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)	PrepoTech Inc.	450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF)	PrepoTech Inc.	450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1)	PrepoTech Inc.	100-11
Cyclic AMP (cAMP)	Sigma	D-0260
Sonic hedgehog (SHH)	R&D	1845-SH
50 ml tubes	Becton Dickinson (BD)	352098
15 ml tubes	BD	352097
6 well plates	BD	353046
24 well plates	BD	353047
T25 flasks (untreated)	BD	353009
T75 flasks (untreated)	BD	353133
Coverslips	Chemiglass Life Sciences	1760-012
6 cm Petri dishes	BD	353004
9'' glass pipetes	Fisher	13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM)	Millipore	SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM)	Millipore	SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1)	Zeiss	R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)	Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance)	The Baker Company
Centrifuge (5702 R)	Eppendorf