人鼻粘膜上皮细胞在气液界面培养

摘要

鼻粘膜上皮细胞，通过志愿者的浅表刮活检，是扩大和转移到组织培养插入。一旦达到融合，细胞生长在空气液体界面，产生纤毛和非纤毛细胞的培养。分化鼻粘膜上皮细胞培养提供可行的实验模型为研究呼吸道黏膜。

摘要

在使用体外模型的人原代上皮细胞是在理解微生物感染或吸入剂的情况下的呼吸道上皮关键功能是必不可少的。细胞的患病人群中获得的直接比较让我们来描述不同表型和解剖调解变化上皮细胞功能的基本机制。培养从人支气管区域的上皮细胞已被很好的记载，但通过与获得的支气管刷活组织检查相关的人类肺组织或侵袭的可用性的限制。鼻粘膜上皮细胞通过较少侵入性的浅表鼻刮活检获得，主体可以活检多次无显著副作用。此外，鼻子的入口点的呼吸系统和因此的第一站点被暴露于任何种类的空气传播的应激物，如微生物剂1，污染物，或过敏原。

简要地说，从人类志愿者获得的鼻上皮细胞上涂覆的组织培养板中膨胀，然后转移到细胞培养插入。在达到汇合，将细胞继续在气 - 液界面（ALI），以进行培养，持续数周，从而产生更多的生理相关的条件。 ALI的培养条件下用确定的培养基导致了分化的上皮细胞表现出形态和功能特征类似于人的鼻上皮，既纤毛和黏液分泌细胞。组织培养插入分化鼻上皮细胞可在各种不同的方式来操作取决于研究问题（治疗用药物制剂，转导与慢病毒载体，暴露于气体或感染微生物剂），并为许多不同的端点，从分析细胞和分子通路，通道功能安格斯，形态等。

在分化的人类鼻黏膜上皮细胞的体外模型将使研究者通过实验器官模型，主要模拟体内鼻腔上皮细胞，以解决新的和重要的研究问题。

引言

该技术的目的

在气道上皮细胞（EC），其中的第一个位点被直接暴露于吸入的环境压力，如病原体，变应原或污染物。内皮细胞多于一个结构性障碍：他们作为一个交换机通过可溶性介质^4-6和配体/受体对他们的表面活性^7-9表达式的释放来启动和调节呼吸系统的免疫反应^1-3。虽然永生化的细胞系可作为模型来研究呼吸内皮细胞在体外 ，它们不能分化成偏振纤毛和黏液分泌细胞，类似的是， 在体内观察到的由异质细胞群。扼要重述在体内观察到的呼吸道上皮细胞的重要特征，主气道的EC可以被使用。因此，我们的目标是优化我们利用鼻内皮细胞（邻舍）方法从人类志愿者获得。在NEC的是在体外扩增和培养，得到分化邻舍的细胞培养模型模仿许多的鼻上皮见于体内的功能。

合理

使用体外模型与人类原发性内皮模仿体内的情况-如本研究中所描述-赋予独特的可能性，研究内皮细胞的疾病的具体差异，与气道上皮细胞相关生理参数，或内皮细胞和其他细胞类型之间的相互作用，如树突细胞^10，自然杀伤细胞¹¹或巨噬细胞。现有的几种方法利用支气管内皮细胞，它可以侵入通过刷活检支气管镜检查过程中获得，或者从其他废弃肺组织^12-17。此外，商业来源获得完全分化的人类呼吸道上皮细胞培养从MatTek，阿什兰，马萨诸塞，Clonetics存在（EpiAirway模型从龙沙，瑞士巴塞尔，MucilAir从Epithelix非典，瑞士日内瓦），其中研究人员可以从不同的捐赠者选择。因为市售的上皮细胞，限制或规定的一套参数的有限池然而，与市场上取得初级人类呼吸道内皮细胞相关的成本，以及有限的访问丢弃肺组织或刚获得的人支气管活检组织，禁止许多研究者从开展研究中完全分化的人类呼吸道内皮细胞。因此，我们着手开发，将1）利用非侵入性得到人类邻舍，2）提供了一个协议产生的分化的人类呼吸道上皮细胞培养，以及3）与现有组织培养的基础设施大部分实验室的设置可再现的技术。

优于现有的技术/型号

获得新鲜的邻舍，较支气管或者小气道的精英，很多创伤小，个别S可活检多次无显著副作用，而且肤浅的鼻刮活检可以，否则将不符合研究相关的支气管镜检查患病人群进行。非侵入性的浅表刮活检以获得长者邻舍中心允许研究者设置捐助规范是先验的 ，包括年龄，性别，疾病状况等按照要完成的研究目标。因此，在设计调查研究时，研究者没有被临床上可用的组织/上皮标本的限制，购买自商业供应商，或设计侵袭性纤维支气管镜研究昂贵的分化细胞培养模型。此外，易于获得NEC的增加，从不同供体进行的实验中的细胞，从而提高观察结果的统计验证的能力。最后，鼻子是第一的网站暴露于任何种类的空气传播的压力之一。因此，生成的器官体外培养系统模仿鼻腔上皮细胞是研究吸入病毒颗粒，污染物，过敏原，或气体，这可以通过使用这种细胞培养系统很容易实现的是有用的。

研究方案

1。准备塑胶制品：大衣板

1. 加入500μlPureCol（1:100稀释，用无菌水）的12孔板的每个孔中。
2. 在孵化器30分钟，在37℃，取出PureCol和冲洗用HBSS右侧的单元格将被添加到板前（参见下面的步骤3.1）。

2。获取和人类长者邻舍中心预处理活检

1. 鼻刮活检
   1. 获得肤浅的内皮细胞通过9毫米可重复使用的聚丙烯鼻窥器（型号22009）上的操作与耳镜衬窥器直视下鼻甲（型号21700）。该器件提供了鼻甲和运动灵活性的最佳视觉效果。
   2. 在头往后仰稍或卧在检查表中的仰卧位太师椅坐在直立的主题进行活组织切片检查。
   3. 将耳镜窥器插入鼻孔和下turbi内特 - 可视化与照明。
   4. 通过窥镜插入无菌热塑性刮匙与向远侧延伸至鼻甲背面的小费。
   5. 使用上的鼻甲的下表面温和的压力，刮匙被吸入穿过粘膜表面5倍和缩回。通过毛细管作用保持黏膜细胞的成功提取将是显而易见的，在杯子的刮匙。
2. 把样品在15毫升锥形管中装有8毫升的RPMI 1640中，传输在冰上。
3. 使用镊子检索探头，打跑组织从犀牛探头与P-1000移液器，丢弃探头
4. 离心沉淀（4℃，400×g离心5分钟），吸出上清液（注意：注意不要吸入颗粒）。
5. 重悬沉淀在1ml BEGM用10微升的100×DNA酶1。
6. 在室温下孵育20分钟。
7. 离心（4℃，400×g离心5分钟），不要吸出上清液！

3。 SEED对塑料的细胞（0天）

1. 从板块中删除PureCol和冲洗用HBSS（参见步骤1.2）。
2. 加BEGM + +介质的最小体积（80-100微升，直到介质的弯月面会出现在井的中心）到1-4孔中的涂板（取决于活检大小）。
3. 使用P-1000移液管小心地从管中取出活检组织的粒料，不吸过多介质。
4. 转移球团入井的中间，保持活检一起作为小区的集群，而不要打散，使单细胞悬液。一个好的切片产量可达4口井，可播种。将板放入组织培养箱（37℃，5％CO _2，> 90％相对湿度）。
5. 检查后两小时，以保证有足够的介质（不干扰弯月面）。
6. 第1天，24小时后播种：收集所有井的所有非贴壁细胞（倾斜板，并收集在一个P-1000，C与细胞介质在1.5ml的离心管中ollect所有孔中）。
7. 离心（4℃，400×g离心5分钟）。
8. 而离心细胞悬浮液：向接种在第0天的细胞中加入约250μl的BEGM + +和250微升的BEGM +介质的混合物。
9. 重复步骤3.1-3.5的非贴壁细胞。
10. 一天2-5：每日细胞变化的媒体;加入500μl的媒体，每孔，减少BEGM +媒体逐步（2天量播种后：125微升BEGM +加375μLBEGM +，播种后第3天及以下天数：73微升BEGM +加427μLBEGM +）。

4。扩大细胞在烧瓶

1. 每天监测细胞，一旦他们达到80-90％汇合（通常在活检后5-7天，如果他们需要更长的时间，他们不会成功发展）电梯细胞如下：小心吸介质;加入500微升0.25％胰蛋白酶每口井，让他们在37°C，直到细胞被分离（通常需要2-3分钟）。
2. 准备需要大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）（每1ml胰蛋白酶750微升）在15毫升管版体积。
3. 通过反复上下吹打的胰蛋白酶溶液移去细胞;转移分离的细胞中的15毫升锥形管与SBTI。
4. 冲洗所有井，共有1毫升的HBSS，加入HBSS到管细胞。
5. 离心沉淀（4℃，400×g离心5分钟），吸1毫升BEGM +媒体的媒体，重悬，涡旋管。
6. 这取决于颗粒的大小扩大在T25或T75瓶中的细胞（这是P1，大约两汇合口井去到一个T75瓶中，一是融合以及足够一个T25，一般2汇合口井产生一个T75）。
   1. 加BEGM +向烧瓶（每次5毫升一T75，将3ml每一个T25）。
   2. 添加细胞悬浮液的烧瓶中。转移到烧瓶组织培养箱。
7. 24小时后瓶中接种：添加额外的BEGM +媒体向烧瓶（3毫升到一个T25，将10毫升至T75）。
8. 维持细胞在培养瓶中：移除介质（分泌物从眼角），并添加BEGM +媒体（5 ml/T25，20 ml/T75）。媒体需要改变每2-3天。维持细胞在烧瓶中，直至其大致80％融合（融合未必甚至在整个烧瓶，通常这需要7-10天之间，如果他们在10天后都没有汇合他们不会成长成功）。

5。种子的组织培养插入单元格

1. 从烧瓶中取出介质，并加入胰蛋白酶（3毫升的T25 4毫升T75瓶）。
2. 孵育在37℃，直至细胞被分离（约2-3分钟）。
3. 准备SBTI（每1ml胰蛋白酶750微升>2.25毫升为T25，将3ml于T75）在一个15毫升管。
4. 用胶带将烧瓶和上下吹打移去细胞，并转移到锥形管与SBTI。
5. 冲洗烧瓶用HBSS（1毫升T25 2毫升T75），添加HBSS到15ml试管中。
6. 离心分离机沉淀（4℃，400×g离心5分钟），小心取出上清液。
7. 准备板：决定多少板将要去籽，用标记示例代码和号码，通道数（ 即 P2）和日期的板块。加入700μlBEGM +介质基底室。
8. 通过涡旋管重悬细胞沉淀在1ml BEGM ALI媒体。
9. 计数细胞，用血细胞计数器（一个T25通常会产生约4百万个细胞，一T75可以有多达20亿个细胞依赖于胰岛，使用1-2万细胞一12孔板）和稀释细胞悬液，用BEGM ALI媒体所需的板应接种（1.2×10 ⁶细胞每盘2.5毫升媒体）的金额总量（注：如果细胞的一部分要被冻结，标示管和去除细胞在这里：我们通常冻结2×10 ^6个细胞在2毫升冷冻介质）
10. 添加200μl的细胞悬浮液以每个未包衣康宁12well细胞的顶侧插入（>这将约80,000-150,000个细胞/插入物;12毫米转孔用0.4微米孔径的聚酯（聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）等）的膜插入物）;转移到组织培养箱中。
11. 24小时后，改变心尖媒体（200微升膨胀介质）。
12. 维护细胞培养：更改介质（BEGM ALI媒体; 700微升基底和200微升顶）隔日一次。刀片必须保持淹没，直到细胞完全融合（单层无孔可见）。根据细胞数量，这通常需要2-6天之间，如果需要更长的电池将最有可能是不可行的。

6。建立空液界面一旦细胞被完全合流（当在转孔的细胞是完全合流）

1. 一旦细胞完全融合与补充500NM维甲酸48小时BEGM ALI媒体更换两个心尖和基底介质。
2. 加入维甲酸后48小时补充BEGM ALI媒体：准备PneumaCult-ALI 维护中（以下制造商的说明）：计算所需介质的体积（一板通常8.5毫升为基底室），每1 ml加入PneumaCult完整的基础培养基：

   10微升PneumaCult 100X维护补充
   2微升肝素（的2毫克/毫升储液）
   5微升氢化可的松（一个96微升/毫升的储备溶液）。

3. 取出所有介质，加入700μlPneumaCult-ALI维护媒体的基底侧只（在顶面上无介质）。
4. 维持细胞培养4周的ALI：
   1. 每隔一天（周一，周三和周五的日程安排很适合我们）改变媒体。
   2. 1周在ALI后，一个星期（星期三），一旦顶表面清洗：加入200μl的HBSS到心尖的一面，让他们在孵化10分钟，小心吸出HBSS（使用玻璃吸管9安装在真空陷阱中的生物安全柜，用200微升技巧上的吸管尖抽吸掉HBSS）。

注：板块之间切换的提示，以及从根尖表面会与基底膜改变时的提示。约2周后在急性肺损伤，细胞开始分化和纤毛出现。细胞培养后约4周在ALI达到完全分化。

结果

NEC的培养继此处描述的协议重新分化成内皮细胞的异质层纤毛和非纤毛细胞，相当于本体内的情况（ 图1）构成的。有些区别的长者邻舍中心是粘液产生（细胞蓝染色使用AB / PAS， 图1B）。尽管这里介绍的协议进行了优化，分 ​​化可以与问候的整体细胞群（：粘液产生细胞： 即不同比例纤毛细胞的非纤毛细胞）的分布有所不同，甚至得到更多的鳞状上皮?...

讨论

呼吸道内皮细胞不仅提供了一个物理屏障，以保护人体从外源性刺激^20，而且还充当交换机通过可溶性介质或直接的受体-配体细胞间的相互作用的分泌，启动和调节呼吸道的免疫防御反应^1-3。为了进一步研究内皮细胞在免疫应答中的作用，研究从患病人群内皮细胞之间的电势差，或者以研究对内皮细胞的外源应激的影响，它概括了在体内的情况是很重要的。人类呼吸道含有...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nasal speculum	Welch Allyn	Model 22009	9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope	Welch Allyn	Model 21700
Rhino probe cell cuvette	Arlington Scientific	SY-96-092	bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates	Corning	3512
Transwell membrane cell culture inserts	Corning	3460
Tissue culture flask	Corning	430639 and 430641	T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine)	Gibco	11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium	Cell applications	511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3170	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	Gibco	25080	Use as it is.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Use as it is.
BAMBANKER freezing media	BAMBANKER	302-14681	Use as it is.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red	Gibco	25200-056	Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)	Sigma	T6522	Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid	Sigma	R7632	Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate	Gibco	11995
Bovine Pituitary Extract	Gibco	13028-014	Used for BEGM ALI media.
Nystatin	Sigma	N4014-50 mg	Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100	Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone	StemCell	7904	Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	Use at it is.
Filter flasks (500 ml)	Corning	431097	0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips	Molecular Bioproducts	2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for General remark: always warm the media to room temperature BEGM media 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid (mix them half-half and filter ) 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements digestion of the biopsy BEGM+ media 50 ml BEGM media maintaining cells on plastic in the plates (passage0) 10 μl retinoic acid (working solution) seeding cells in the flask (passage1; partially) maintain the cells in the flask BEGM++ media 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements seeding fresh cells in 12-well plate on plastic 1 ml Sodium BiCarb maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially) 2.5 ml NuSerum seeding cells in the flask (passage1; partially) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Maintaining cells on the transwell before they go ALI 250 ml BEGM including supplements 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution) 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution) 75 μl BSA (10 mg/ml solution) 200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution) 200 μl dissolved hydrocortisone As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts 4250 μl dissolved sodium chloride 540 μl ddH2O 10 μl absolute ethanol Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles PneumaCult-ALI Complete Base Media 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium Base medium for all three PneumaCult-ALI media 50 ml PneumaCult 10x Supplement The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark (this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C) PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)