A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

Resumo

Células epiteliais nasais, obtidas através de biópsia superficial raspar de voluntários humanos, são expandidas e transferido para tecido inserções de cultura. Ao atingir a confluência, as células são cultivadas na interface ar-líquido, obtendo-se culturas de células ciliadas e não ciliadas. Culturas de células epiteliais nasais diferenciados fornecem modelos experimentais para o estudo de viáveis ​​da mucosa respiratória.

Resumo

Os modelos in vitro utilizando células epiteliais primárias humanas são essenciais para a compreensão das principais funções do epitélio respiratório no contexto de infecções microbianas ou agentes inalados. Comparações diretas de células obtidas de populações doentes nos permitem caracterizar diferentes fenótipos e dissecar os mecanismos subjacentes mediando mudanças na função da célula epitelial. A cultura de células epiteliais da região traqueobrônquica humana tem sido bem documentada, mas é limitado pela disponibilidade de tecido de pulmão humano ou invasividade relacionado com a obtenção das escovas biópsias brônquicas. Células epiteliais nasais são obtidos através de biópsias superficiais raspar nasal muito menos invasivos e os assuntos podem ser biopsiados várias vezes, sem efeitos colaterais significativos. Além disso, o nariz é o ponto de entrada para o sistema respiratório e, portanto, um dos primeiros locais a serem expostas a qualquer tipo de estressor transportada pelo ar, como agentes microbianos, poluentes, ou alérgenos.

Resumidamente, as células epiteliais nasais obtidos a partir de voluntários humanos são expandidos em placas de cultura de tecidos revestidos, e em seguida transferida para inserções de cultura de células. Ao atingir a confluência, as células continuam a ser cultivadas na interface ar-líquido (ALI), durante várias semanas, o que cria condições mais fisiologicamente relevantes. A condição cultura ALI usa a mídia definidas levando a um epitélio diferenciado que apresenta características morfológicas e funcionais semelhantes ao epitélio nasal humano, com células ciliadas e mucosas tanto produzindo. Inserções de cultura de tecidos com células epiteliais nasais diferenciadas pode ser manipulado numa variedade de maneiras dependendo das questões de pesquisa (tratamento com agentes farmacológicos, de transdução com vectores lentivirais, a exposição a gases, ou infecção com agentes microbianos) e analisados ​​por numerosos pontos de extremidade diferentes, desde caminhos celulares e moleculares, ch funcionalanges, morfologia, etc

Em modelos in vitro de células epiteliais nasais humanos diferenciados permitirá que os investigadores a abordar novas e importantes questões de pesquisa, utilizando modelos experimentais organotípicas que grande parte imitar o epitélio nasal in vivo.

Introdução

Objetivo da técnica

As células epiteliais (ECS) nas vias aéreas estão entre os primeiros locais a serem diretamente expostos a estressores ambientais inalados, tais como patógenos, alérgenos ou poluentes atmosféricos. ECs são mais do que uma barreira estrutural: Eles agem como uma central para iniciar e regular a resposta imune respiratório ^1-3 através da liberação de mediadores solúveis ^4-6 ea expressão de ligantes / receptores em sua surfac ^7-9. Enquanto as linhas de células imortalizadas podem ser utilizados como modelos para estudar CEs respiratórias in vitro, eles não conseguem diferenciar-se em populações de células heterogéneas compostos de ciliado polarizada e as células produtoras de muco, semelhante ao que se observa in vivo. Para recapitular características importantes do epitélio respiratório observada in vivo, os CEs das vias primárias podem ser usadas. Portanto, nosso objetivo foi otimizar o nosso método utilizando nasal ECs (CNE) obtido de voluntários humanos. Os CNE são expandidas e cultivadas in vitro, produzindo um modelo de cultura de células de CNE diferenciadas que imita muitas das características do epitélio nasal visto in vivo.

Análise racional

O uso de modelos in vitro com células endoteliais humanas primárias imitando em situação vivo - como descrito neste estudo - dá possibilidades únicas para estudar diferenças de doenças específicas de ECs, parâmetros fisiológicos associados com o epitélio das vias aéreas, ou as interações entre células endoteliais e outros tipos de células, tais como células dendríticas ^10, células natural killer ¹¹ ou macrófagos. Vários métodos existentes utilizam CEs brônquicas, que podem ser obtidas de forma invasiva por meio de biópsias da escova durante broncoscopia, ou a partir de tecido de pulmão de outra forma descartadas ^12-17. Além disso, as fontes comerciais para a obtenção de culturas de células das vias respiratórias humanas epiteliais completamente diferenciadas existir (modelo EpiAirway da MatTek, Ashland, MA, Cloneticsda Lonza, Basiléia, Suíça, a partir MucilAir Epithelix Sars, Genebra Suíça), onde os investigadores podem escolher entre diferentes doadores. No entanto, por causa do conjunto limitado de células epiteliais disponíveis comercialmente, ou limitadas conjunto prescrito de parâmetros, o custo associado com a obtenção comercialmente vias respiratórias humanas primárias ECs, e o acesso limitado a tecido pulmonar ou tecido descartado biópsia brônquica humana recentemente obtida, proibir muitos investigadores da realização de estudos em ECs vias aéreas humano totalmente diferenciadas. Por isso, nos propusemos a desenvolver uma técnica que irá 1) utilizar CNE humanos não-invasiva obtidos, 2) fornecer um protocolo produzindo culturas do epitélio das vias aéreas humano diferenciado, e 3) ser reprodutível na maioria dos ambientes de laboratório com uma infra-estrutura de cultura de tecido existente.

Vantagens sobre as técnicas existentes / Modelos

Obtenção CNE frescos, em comparação com brônquica ou pequenas vias aéreas ECs, é muito menos invasivo, individuaiss pode ser biópsia várias vezes, sem efeitos colaterais significativos, e superficiais biópsias raspar nasais podem ser realizadas em populações doentes que de outra forma não se qualificariam para bronchoscopies relacionadas com a investigação. Não-invasivos biópsias raspar superficiais para obter CNE permitir que o investigador para definir especificação doador a priori, incluindo idade, sexo, estado da doença, etc, de acordo com o objetivo da pesquisa a ser realizada. Assim, ao projetar estudos de investigação investigadores não estão limitados pelos tecidos clinicamente disponíveis / amostras epiteliais, comprar modelos de cultura de células diferenciadas caros de fornecedores comerciais, ou de projeto de broncoscopia estudos invasivos. Além disso, a facilidade de obter CNE aumenta a capacidade de realizar as experiências em células a partir de doadores diferentes, o que aumenta a validação estatística dos resultados observados. Por último, o nariz é um dos primeiros locais a serem expostas a qualquer tipo de estressores transmitidas pelo ar. Assim, a geração de organotípicas emsistemas de cultura in vitro que imitam o epitélio nasal são úteis para o estudo de inalação de partículas virais, poluentes, alérgeno, ou gases, que podem ser facilmente obtidos pela utilização deste sistema de cultura de células.

Protocolo

1. Prepare Plastic Ware: Brasão Placa

1. Adicionar 500 ul PureCol (1:100 diluído em água esterilizada) para cada poço de uma placa de 12 poços.
2. Incubar a 37 ° C numa incubadora durante 30 min, remover o PureCol e enxagua-se com HBSS a direita antes as células são adicionadas à placa (ver passo 3.1).

2. Obtenção e pré-tratamento de Biópsia de CNE Humano

1. Biópsia raspar Nasal
   1. Obter ECs superficiais que revestem os cornetos nasais sob visão direta através de um espéculo nasal polipropileno reutilizável 9 mm (modelo 22009) em um otoscópio operacional com espéculo (modelo 21700). Este dispositivo proporciona melhor visualização dos cornetos nasais e flexibilidade de movimento.
   2. Execute as biópsias com o indivíduo sentado ereto em uma cadeira de encosto reto com a cabeça inclinada ligeiramente para trás ou deitado em decúbito dorsal sobre uma mesa de exame.
   3. Insira o espéculo otoscópio na narina ea Turbi inferiornate visualizado com iluminação.
   4. Inserir uma cureta termoplástico estéril através do espéculo com a ponta estendida distal à volta da concha.
   5. Usando uma leve pressão sobre a superfície inferior da concha, a cureta é traçada através da superfície da mucosa 5x e retraída. A recuperação bem sucedida de células da mucosa detidas por ação capilar será evidente no copo da cureta.
2. Colocar a amostra em um tubo de 15 ml contendo 8 ml de RPMI 1640, o transporte de gelo.
3. Use uma pinça para recuperar a sonda, desalojar tecido da sonda rinoceronte com uma pipeta P-1000, descarte sonda
4. Centrífuga para sedimentar (4 ° C, 400 xg, 5 min), o sobrenadante aspirado (atenção: cuidado para não aspirar o pellet).
5. Ressuspender o sedimento em 1 ml BEGM com 10 ul de DNase 1 100x.
6. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
7. Centrífuga (4 ° C, 400 xg, 5 min), NÃO aspirar o sobrenadante!

3. Seed as células em plástico (Dia 0)

1. Remover o PureCol a partir da placa e enxaguar com HBSS (ver também o passo 1.2).
2. Adicionar um volume mínimo de BEGM media + + (80-100 ul, até que um menisco de meios de entrada aparece no centro do poço) para poços de 1-4 (dependendo do tamanho da biópsia) da chapa revestida.
3. Use uma pipeta P-1000 para remover cuidadosamente o sedimento do tecido da biópsia do tubo, sem aspiração demais meios de comunicação.
4. Transfira o granulado para o meio dos poços, manter a biópsia juntamente como um aglomerado de células, e não se rompem para fazer uma suspensão de células individuais. Um bom rendimento de biópsia até quatro poços que podem ser semeadas. Colocar a placa na incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% de CO _2,> 90% de humidade relativa).
5. Verificar depois de duas horas para assegurar que não há meios de suficiente (sem perturbar o menisco).
6. Day1, 24 hr pós-semeadura: coletar todas as células não aderentes de todos os poços (placa de inclinação e recolher mídia com células em um P-1000, collect todos os poços em um tubo de centrífuga de 1,5 ml).
7. Centrífuga (4 ° C, a 400 x g, 5 min).
8. Enquanto centrifugação suspensão celular: cerca de 250 ul de BEGM + + e 250 ul de mistura media BEGM + para as células semeadas no dia 0.
9. Repita os passos de 3,1-3,5 para as células não-aderentes.
10. Dia 2-5: mídia alteração das células diárias; adicionar 500 media ul a cada poço, reduzir a quantidade de BEGM + + media por etapas (dia 2 após a semeadura: 125 mL BEGM + + plus 375 mL BEGM +, dia3 após a semeadura e os seguintes dias: 73 ul BEGM + +, mais 427 ul BEGM +).

4. Expansão das células nos frascos

1. Monitorar as células diariamente, uma vez que eles chegaram a 80-90% de confluência (geralmente 5-7 dias após a biópsia, se demorar mais tempo eles não vão crescer com sucesso), as células de elevação da seguinte forma: a mídia cuidadosamente aspirado, adicione 500 mL de tripsina a 0,25% por poço, mantê-los a 37 ° C até as células são separadas (que normalmente leva 2-3 min).
2. Prepare a necessidadeed volume de feijão de soja de Inibidor de Tripsina (SBTI) (750 ul por 1 ml de tripsina) em um tubo de 15 ml.
3. Desalojar células por pipetagem cima e para baixo várias vezes a solução de tripsina; transferência de células isoladas no tubo cônico de 15 ml com SBTI.
4. Lavar todos os poços com um total de 1 ml de HBSS, adiciona HBSS para o tubo com as células.
5. Centrífuga para sedimentar (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirar a mídia, ressuspender em 1 ml + media BEGM e vortex o tubo.
6. Expandir as células em um frasco T25 ou T75, dependendo do tamanho da pelota (esta é p1; cerca de dois poços confluentes entrar em um frasco T75, um confluente bem é o suficiente para uma T25, geralmente 2 poços confluentes deu um T75).
   1. Adicionar BEGM + aos balões (5 ml de cada vez para um T75, 3 ml de cada uma para um T25).
   2. Adicionar a suspensão de células para os frascos. Transferir os frascos num incubador de cultura de tecido.
7. 24 horas pós-balão de semeadura: adicionar mídia adicional BEGM + para o balão (3 ml para um T25, 10 ml a um T75).
8. manter as células em frascos: Remova a mídia (aspirado a partir do canto) e adicionar BEGM + media (5 ml/T25, 20 ml/T75). A mídia precisa ser trocado a cada 2-3 dias. Manter as células do frasco até que sejam aproximadamente 80% confluentes (confluência pode não ser uniforme em toda a garrafa inteira; normalmente esta demora entre 7-10 dias, se eles não são confluentes depois de 10 dias, eles não irão crescer com sucesso).

5. Semente as células em cultura de tecidos Inserções

1. Remova a mídia do frasco e adicione tripsina (3 ml para T25, 4 ml para frasco T75).
2. Incubar a 37 ° C até as células são separadas (aproximadamente 2-3 minutos).
3. Prepare SBTI (750 ul por 1 ml de tripsina> 2,25 ml para T25, T75 para 3 ml) num tubo de 15 ml.
4. Desalojar células gravando o frasco e pipetando para cima e para baixo e transferir para tubo cônico com o SBTI.
5. Lavar o balão com HBSS (1 ml para T25, 2 ml para T75), adicione o HBSS para o tubo de 15 ml.
6. Centrifugadorpara sedimentar (4 ° C, a 400 x g, 5 min), remover o sobrenadante cuidadosamente.
7. Prepare as placas: decidir quantas placas vão ser semeado, rotular as placas com código de amostra e número, número de passagens (ou seja, p2) e data. Adicionar 700 ul BEGM + meios de comunicação para a câmara de basal.
8. Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de meio BEGM ALI em vortex do tubo.
9. Contar as células com um hemocitómetro (um T25 geralmente produz cerca de 4 milhões de células, um T75 pode ter até 20 milhões de células em função do ilhéu; utilizar de 1-2 milhões de células para uma placa de 12 poços) e dilui-se a suspensão de células com mídia BEGM Ali para o volume total necessário para a quantidade de placas que deve ser semeado (1,2 x 10 ⁶ células em 2,5 ml de mídia por placa) (Nota:. Se parte das células quer ser congelado, o rótulo do tubo e remover as células aqui: nós geralmente congelar 2 x 10 ⁶ células em 2 ml de meio de congelamento)
10. Adicionar 200 ul de suspensão de célula para o lado apical de cada célula Corning 12well não revestidoinserir (> este será de cerca de 80,000-150,000 células / inserção; 12 transwells mm com 0,4 mM poros poliéster (Polietileno Tereftalato (PET)) insert membrana); transferir para cultura de tecidos incubadora.
11. Após 24 horas, alterar a mídia apical (200 mL meio de expansão).
12. A manutenção de culturas de células: Troque a mídia (media BEGM ALI; 700 mL basolateral e apical de 200 mL) a cada dois dias. Inserções tem que ser mantida submersa até que as células são totalmente confluente (sem buracos em monocamada são visíveis). Dependendo do número de células isso geralmente leva entre 2-6 dias, se leva mais tempo as células provavelmente não será viável.

6. Estabelecer Ar Líquido de Interface Uma vez que as células são completamente confluente (Quando as células na Transwells são completamente confluente)

1. Uma vez que as células são completamente confluentes substituir ambos os meios apical e basolateral com a mídia BEGM ALI suplementadas com ácido retinóico 500nM para 48 horas.
2. 48 horas após a adição do ácido retinóico suplementado mídia BEGM ALI: Preparar PneumaCult-ALI Meio de Manutenção (instruções seguinte do fabricante): Calcular o volume de meio necessário (para uma placa geralmente de 8,5 ml para os compartimentos basais); adicionar por 1 ml PneumaCult Meio Completo Base de Dados :

   10 ul PneumaCult 100x Suplemento Manutenção
   2 uL de heparina (de uma solução de estoque a 2 mg / ml)
   5 ul de hidrocortisona (de uma solução mãe de 96 ul / ml).

3. Remova toda a mídia e adicionar 700 mL PneumaCult-ALI mídia manutenção para o lado basolateral apenas (sem meio no lado apical).
4. Manter as culturas de células durante 4 semanas no ALI:
   1. Troque a mídia a cada dois dias (segunda, quarta e sexta-feira agenda funciona bem para nós).
   2. Depois de uma semana a LPA, uma vez por semana (quarta-feira) à superfície apical é lavado: adiciona-se 200 uL de HBSS ao lado apical, mantê-los durante 10 minutos na incubadora, aspirar cuidadosamente oHBSS (usar uma pipeta de vidro 9 em anexo para a armadilha de vácuo na câmara de segurança biológica, a utilização de 200 ul dicas sobre a ponta da pipeta para aspirar para fora da HBSS).

Nota: Alterar dicas entre as placas, bem como alterar as dicas quando vai da superfície apical contra basolateral. Após cerca de 2 semanas no ALI, as células começam a se diferenciar e cílios aparecem. As culturas celulares alcançar diferenciação completa após cerca de 4 semanas no ALI.

Resultados

CNE cultivadas seguindo o protocolo aqui descrito re-diferenciar-se em uma camada de células endoteliais heterogéneo composto por células ciliadas e não ciliadas, que representam a situação in vivo (Figura 1). Alguns dos CNE diferenciadas são muco produtores (células marcadas em azul usando AB / PAS, Figura 1B). Embora o protocolo aqui apresentado é optimizada, a diferenciação pode variar no que diz respeito à distribuição das populações totais de células (...

Discussão

ECs respiratórias fornecer não apenas uma barreira física para proteger o corpo humano a partir de estímulos exógenos ^20, mas também funcionam como uma central para iniciar e regular as respostas de defesa imunológico respiratórias ^1-3 através da secreção de mediadores solúveis ou interações célula-célula receptor-ligante diretos. A fim de estudar melhor o papel das células endoteliais na resposta imune, para examinar as diferenças de potencial entre os CEs a partir de populaçõe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nasal speculum	Welch Allyn	Model 22009	9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope	Welch Allyn	Model 21700
Rhino probe cell cuvette	Arlington Scientific	SY-96-092	bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates	Corning	3512
Transwell membrane cell culture inserts	Corning	3460
Tissue culture flask	Corning	430639 and 430641	T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine)	Gibco	11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium	Cell applications	511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3170	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	Gibco	25080	Use as it is.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Use as it is.
BAMBANKER freezing media	BAMBANKER	302-14681	Use as it is.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red	Gibco	25200-056	Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)	Sigma	T6522	Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid	Sigma	R7632	Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate	Gibco	11995
Bovine Pituitary Extract	Gibco	13028-014	Used for BEGM ALI media.
Nystatin	Sigma	N4014-50 mg	Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100	Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone	StemCell	7904	Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	Use at it is.
Filter flasks (500 ml)	Corning	431097	0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips	Molecular Bioproducts	2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for General remark: always warm the media to room temperature BEGM media 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid (mix them half-half and filter ) 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements digestion of the biopsy BEGM+ media 50 ml BEGM media maintaining cells on plastic in the plates (passage0) 10 μl retinoic acid (working solution) seeding cells in the flask (passage1; partially) maintain the cells in the flask BEGM++ media 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements seeding fresh cells in 12-well plate on plastic 1 ml Sodium BiCarb maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially) 2.5 ml NuSerum seeding cells in the flask (passage1; partially) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Maintaining cells on the transwell before they go ALI 250 ml BEGM including supplements 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution) 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution) 75 μl BSA (10 mg/ml solution) 200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution) 200 μl dissolved hydrocortisone As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts 4250 μl dissolved sodium chloride 540 μl ddH2O 10 μl absolute ethanol Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles PneumaCult-ALI Complete Base Media 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium Base medium for all three PneumaCult-ALI media 50 ml PneumaCult 10x Supplement The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark (this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C) PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)