解剖和斑马鱼的胚胎横向安装：脊髓发展分析

摘要

发育过程，如增殖，图案，分化和轴突导向可以很容易地模拟在斑马鱼的脊髓。在这篇文章中，我们描述了一个安装程序，斑马鱼的胚胎，从而优化了这些事件的可视化。

摘要

斑马鱼的脊髓是神经系统研究的一个有效的调查模式有以下几个原因。首先，基因，转基因和基因敲除的方法可以被用来检查相关的神经系统发育的分子机制。其次，同步发育胚胎的大型离合器提供大型实验的样本量。三，斑马鱼胚胎的光学清晰度允许研究人员能够可视祖，胶质和神经元群体。尽管斑马鱼的胚胎是透明的，试样厚度可以阻碍有效的微观可视化。其中一个原因是脊髓和覆体节组织的串联发展。另一个原因是大卵黄球，这仍然是在早期神经发生期间存在。在这篇文章中，我们展示了显微切割和拆除蛋黄固定胚胎，这使得微观可视化，同时保留周围的体节的组织。我们阿尔斯Ø证明斑马鱼胚胎的半永久性的安装。这就允许观察神经发育中的背腹和前后轴线，因为它保留了立体感的组织。

引言

在斑马鱼中的脊髓的可视化是由若干因素的抑制。由于上覆体节的厚度和脊髓的内部位置，在相当长的工作距离是必需的高细胞分辨率。卵黄球（它仍然存在于神经发生的早期阶段），进一步增加了所需的工作距离，并且很容易通过从盖玻片压力损坏。此外，从受损的蛋黄碎屑禁止清晰的组织的可视化。虽然在背腹（DV）轴的横截面是可能的，它们不容易允许同时可视化中的前-后（AP）的轴^1。

为了克服这些障碍，胚胎解剖和幻灯片上。此过程提供了一些好处。首先，斑马鱼胚胎容易出在侧面朝上，这有利于AP轴可视化。第二，去除蛋黄的BAL升降低要求的工作距离，并且限制碎屑。三，本次安装程序允许荧光和明场显微镜。四，安装的胚胎是稳定了几个月，在4°C，使长时间的标本可视化。最后，开发进展发生在眼前段比后段更成熟。为了确保分级匹配脊hemisegments胚胎之间进行比较时，上覆体节组织作为一个指南。例如，第十最后部体节覆盖在第十脊hemisegment，这是在阶段相匹配的胚胎发育当量。完整胚胎此安装程序可方便识别体节。

我们利用遗传学和基因敲除技术研究轴突导向的机制在发展中脊髓。特别是，我们已经确定ROBO2，ROBO3，和DCC所需的连合小学ASCEnding（COPA）轴突路径。使用此处描述的安装过程，我们能够审视腹增长，中线交叉，合缝宽度，背鳍和前增长^2,3。该安装过程也可以应用到DV或脊髓的AP构图。我们已经用这种方法来确定在脊髓的DV图案Wnt信号的下游效应物不同的角色。使用这种安装，我们能够取得的DV标志的分辨率在单细胞水平，并确定分钟图案变化为改变的Wnt信号接收^4,5的结果。此安装程序还允许有丝分裂指数的计算通过抗磷组3或BrdU标记（祖细胞增殖）分化^5。

研究方案

1。安装胚胎（所选择可视化技术，如免疫细胞的完成， 原位杂交等 ）

1. 把胚胎在35毫米的培养皿中充满了选择的缓冲器（ 图1A）。缓冲液的选择是基于标记过程。通常PBS基缓冲剂是合适的。
2. 在解剖显微镜下，用钳，固定头与一对钳子的，而拉远蛋黄与另一对（ 图1B）。或者，使用昆虫针昆虫针固定器轻轻扯远了蛋黄。
3. 使用胚胎扑克（钓鱼线（0.41毫米直径）粘到任何一毛细管或巴斯德吸管）将胚的培养皿中不具有大量的卵黄碎片（ 图1C-D）的一部分。
4. 用玻璃巴氏吸管，吸在尽可能少的液体胚胎成为可能，并克ently吸取它们放到一个滑动（ 图1E）。
5. 轻轻地用实验室擦拭吸走多余的液体。避免与胚胎接触。
6. 加入一滴安装介质胚胎。对于荧光标记，使用选择的抗淬灭剂。对于色度信号，70％的甘油可以用作安装介质。
7. 利用胚胎扑克，定位于行（ 图1F），在其两侧的胚胎。
8. 加入凡士林或高真空硅脂之一“DAB”的盖玻片（ 图1G）的每个角落。这可以防止胚胎的过度压缩的伤害。
9. 放置盖玻片（凡士林面朝下）上的胚胎（ 图1H）的顶部。
10. 轻轻拍打在每个角落盖玻片，直到安装媒体（70％甘油或防褪色安装试剂）接触到盖玻片（ 图1H）。
11. 如果有必要，吹打旁边的CO​​V添加了更多的安装介质erslip，在20-200毫升的范围内使用移液器。这将灯芯下。
12. 用实验室擦拭，彻底干净周围的盖玻片。肯定不施加压力，以盖玻片，因为这样会损坏胚胎。这个区域必须是干燥的，没有凡士林或安装媒体上。
13. 用指甲油密封周围的盖玻片（ 图1I）的边缘。

结果

当阐明背后诸如蜂窝图案形成，分化和轴突导向各个发育事件的机制，它能够为他们的组织的范围内可视化的细胞是重要的。背腹图案缺陷的典型表现为腹部或背部转变的转录因子的表达域在PAX，NKX，或DBX家庭^4。有时，变化可能是微妙的，包括只有少数细胞直径^4。截面分析允许这种类型的分析。然而，试剂与较弱的信号，或者横截面是不垂直于轴的AP可以限制解释。此外，截面分析不容易考虑到的变化是否坚持在AP轴，并依靠低温恒温器的可用性。这个限制是由脊髓侧景规避。正如图2B所示 ，NKX6.1 mRNA表达为distributed中在24小时后受精（HPF）的脊髓大致腹侧一半，祖域之内。祖细胞是从由于底板，这是在脊髓的中间部分发现的存在下交的有丝分裂的细胞区分开来。与DIC的光学来看，单个细胞清晰可辨，并表达和nonexpressing细胞之间的边界定义是显而易见的。

祖细胞周期出口是伴随着基因表达的变化。例如，所有的有丝分裂后神经元表达HUC / D，它是检测与免疫细胞化学^1,5。基因探针胰岛，GATA和VSX系列标记每个脊髓hemisegment ⁶中的一贯立场和一些具体的有丝分裂后神经元。此外，轴突导向受体，如那些在机器人的家庭表示在有丝分裂后神经元的受限人群（ 图2C） ^{2,7,8。胚胎横向安装允许有丝分裂后神经元的准确计数。同样，该祖细胞继续分裂可以量化与抗磷酸化组蛋白3免疫组织化学以及BrdU标记。此外，细胞死亡可以与TUNEL标记4-6进行评估。}

在24个高倍视野，下面的有丝分裂后神经元的轴突可以用各种方法来可视化，并且是可区分的在单细胞水平：背外侧递增（多拉），连合主升序（COPA），连合次要升序（COSA），腹侧纵降序（草原），Kolmer-Agdur（KA），连合分叉/纵向（COB / L），圆周升序（CIA），圆周递减（CID）和单极连合递减（UCOD），Rohon - 比尔德（RB），运动神经元（ ^M）9。轴突从这些神经元在背，腹，前和后方向上延伸。他们的分支，越过中线，并退出这两个背和脊髓腹侧。如果再加上激光共聚焦扫描显微镜，这些不同的细胞行为是明显的横向安装的胚胎，用免疫细胞化学和基因编码的荧光蛋白如GFP ^2。在图2D中 ，ZNP-1免疫细胞化学法用于标记显影运动神经元。退出运动神经元脊髓腹侧以支配周围的肌肉发展。

图1。解剖和横向装载斑马鱼胚胎（A）处理后，免疫荧光， 原位杂交等 ，胚胎放置在35毫米培养皿中填充的PBT（PBS含有0.5％的Triton X-100）或PTW（PBS与0.1％吐温20）。卵黄球（YB）可见一斑。 （B）中的蛋黄是由固定的胚胎随后小心剥离的头部去除。 （C）一种胚胎扑克（渔线粘到巴斯德吸管）用于单独的胚胎和蛋黄碎片（D）。清洗胚胎吸移到载玻片（E）和对齐（F）。 （G）凡士林加到盖玻片的角落。 （H）的盖玻片轻轻地放置在安装介质中的胚胎的顶部。 （ 一）指甲油是用来密封盖玻片的边缘。 点击这里查看大图 。

< STRONG>图2。基因表达模式和轴突路径的分析横向安装的斑马鱼胚胎（A）在24 HPF绘制一个斑马鱼胚胎。在BD，上面卵黄囊延长大约4 hemisegments被可视化（盒装区）。 （B）NKX6.1表达于脊髓腹侧，包括底板（FP）。 （ 三）ROBO3表现在有丝分裂后神经元细胞（PMN）。底板和祖区不是体现在这个更横向焦平面。在B，C，脊髓是通过在图像的左侧的支架为界。 （D）的共焦显微镜检查用于图像ZNP-1免疫荧光法，其中标记运动神经元轴突腹侧离开脊髓。中的所有图像，前壁是向左和背到了。一个40X长工作距离，开水浸泡（NA 0.8）镜头使用（3.3毫米）。oad/50703/50703fig2highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。

讨论

脊髓发展的固定斑马鱼胚胎辅助可视化横向安装。通过除去卵黄球的，需要特殊的显微成像的工作距离被减小。我们的代表性的结果被限制到24个高倍视野的阶段，然而，这种技术可以早在18个高倍视野中使用，尽管早期胚胎是更难以解剖由于胚胎的大小和组织的脆弱性。这种技术也适用于年龄大于24个高倍视野胚胎。由胚胎斑马鱼的光学透明性，执行正向遗传筛选，反向遗传学的能力，并且转基因方法的帮助下，几种发育过程可能进行调查。这包括神经元祖细胞具有类似的BrdU和抗磷酸化组蛋白3月^4日至6日 ，通过在PAX，NKX，DBX，并OLIG FAMILIE神经元和神经胶质祖细胞标记物的表达图案标记有丝分裂指数s ^1,4-6。试剂用于报告胶质和神经元确定（如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和于克/ ^D）1,4,5,10都可以使用。神经元亚型的分化可以通过胰岛，VSX，engrailed基因和转录因子GATA基因^1,4-6的表达进行分析。最后，轴突引导的分析有可能通过抗体诸如抗乙酰化的微管蛋白，3A10和ZNP-1 ^2,11,12。虽然其他脊椎动物模型系统（小鼠和鸡）被用来研究脊髓的发展，只有斑马鱼可以同时观看未受影响胚胎发育的所有轴。

最明显的限制，这种方法是，胚胎是固定的，这就排除了实时成像。事实上，除去（或损坏）的蛋黄结果中快速胚胎死亡，因此是不能够减少使用这种技术的工作距离在活的胚胎。然而，高倍率脊髓合作在活胚胎的RD成像是可能的。为了在实时成像以保持蛋黄，胚胎可以被放置在低气压的幻灯片，它提供的标本和盖玻片之间更大的空间。可选地，几个22毫米x 22毫米的盖玻片可以粘在×1一3在显微镜载玻片或幻灯片上。盖玻片作为一个“桥梁”，为覆盖玻片。如果胚胎是年龄超过18 HPF，三卡因用于麻醉胚胎，以防止移动。而与嵌入琼脂糖活胚胎中工作时，具有完整的蛋黄是必需的0.288毫米的工作距离为deyolked胚胎在24个高倍视野，一个显微镜头为3.3毫米的工作距离是足够的。或者，从deyolked胚来源的外植体培养可使用血浆凝块固定化技术¹³可视化。细胞的不同人群可以通过使用遗传编码荧光蛋白如GFP，mCherry的，或者photocon的被观察vertible染​​枫（仅举几例）。另外，嵌合体胚胎内荧光标记的细胞也可以用这种方法¹⁴观看。

一致的安装技术，可稳定几个月是发育和细胞生物学的重要工具。这个简单的技术是可重复的，允许不同的实验试验之间易于比较。此外，在胚胎行的对齐方式容易进行鉴定后分析具体的胚胎。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri dishes 35 mm x 10 mm	VWR	25373-041
Dumont Forceps #3	Fisher Scientific	NC9839169
Cover glass	Fisher Scientific	12-541-B22X22-1.5
Slides	Fisher Scientific	12-550-343
SlowFade Gold	Fisher Scientific	S36936
ProLong Gold	Life Technologies	P36934
Petroleum Jelly	any grocery store
Loop Holders	VWR	80094-482
Insect Pins	Fine Science Tools	26002-10
Nickel Plated Pin Holders	Fine Science Tools	26016-12
Olympus Stereomicroscope	Olympus	SZ61