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摘要

本文介绍的方法显示了如何将一个商用喷墨打印机与紫外线同时聚合生物印刷。该打印机能够构建三维组织结构，细胞和生物材料。这里展示的研究构建了一个3D neocartilage。

摘要

生物印刷，这是基于热喷墨印刷，是最有吸引力的应用技术在组织工程和再生医学的领域之一。与数字控制单元，支架和生长因子可以精确地沉积到所需的二维（2D）和三维（3D）位置迅速。因此，这种技术是制造组织模仿他们的母语解剖结构的理想方法。为了与原生地带性的组织，细胞外基质成分（ECM）和机械性能工程师软骨，我们开发了使用商用喷墨打印机能够进行3D软骨组织工程同时进行光聚合生物印刷一个平台。人软骨细胞悬浮于聚（乙二醇）二丙烯酸酯（PEGDA），被印刷于通过层 - 层组装三维neocartilage施工。印刷细胞固定在原来的位置存放，由surro支持unding脚手架在同步光聚合。印刷组织的机械性能类似于天然软骨。相对于传统的组织的制造，这需要较长的紫外线曝光，在印刷单元和同步光聚合的存活率显著更高。印刷neocartilage展现了出色的糖胺聚糖（GAG）和Ⅱ型胶原的生产，这与基因的表达相一致。因此，这个平台是理想的精确细胞分布和安排解剖组织工程。

引言

生物印刷基于热喷墨印刷是最有前途的应用技术在组织工程和再生医学的领域之一。数字控制和高吞吐量的打印头单元，支架和生长因子可以精确地沉积到所需的二维（2D）和三维（3D）位置的迅速发展。采用该技术在组织工程和再生医学1-9许多成功的应用已经实现。在本文中，生物印刷一个平台，建立与修改后的惠普（HP）DESKJET 500热喷墨​​打印机和同步光聚合体系。由聚（乙二醇）（PEG）配制合成的水凝胶已经表明维持软骨细胞的生存力和促进软骨ECM生成10,11的容量。此外，光交联聚乙二醇在水中具有低粘度，这使得它非常适合同时聚合物：水溶性高在生物印刷3D化。在本文中，人类软骨细胞悬浮在聚（乙烯）乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA; 3,400兆瓦）的精确打印，构建neocartilage层 - 层与1,400 dpi的三维解析。观察到沉积的细胞在三维支架材料中均匀分布，即生成软骨组织具有优异的机械性能和增强的ECM生成。与此相反，在手动制造的凝胶，而不是其最初沉积仓的底部由于较慢的聚合骨架，而导致不均匀的软骨形成培养后2,3蓄积的细胞。

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研究方案

1，生物印刷平台建立

打印机的修改是基于对HP DESKJET 500热喷墨​​打印机和HP 51626A黑色墨盒。

  1. 取下打印机顶部塑料盖，小心地从盖取下控制面板。
  2. 拆下打印机的顶部和底部之间的3线连接。从底座上拆下打印机的顶部。
  3. 在打印机顶部，取下墨盒下在右边的小塑料及橡胶配件（打印头清洗系统）。
  4. 取出进纸托盘与弹簧的基础。
  5. 取下金属板覆盖塑料纸吧。
  6. 切断在用手锯或其它切割工具的中间进料轮位置的塑料纸吧。
  7. 除去前面的步骤之后露出的2进纸轮。轮子的塑料是很难和一个电子锯会有所帮助。
  8. 使用清洁的空气罐头和乙醇擦拭的灰尘和碎屑。
  9. 将打印机顶部部分到基座上。
  10. 使用之前UV消毒至少2小时在层流罩的改性打印机。
  11. 切断用手锯或其他切削工具的HP 51626A墨盒的盖子。
  12. 清空墨水和撕下软骨底部以及水库的过滤器。
  13. 彻底用流动的自来水冲洗墨盒。
  14. Ultrasonicate盒在去离子（DI）水10分钟以除去残留的墨水。
  15. 检查墨盒，以确保所有的墨水已被删除。冲洗或喷雾彻底盒用70％乙醇消毒，接着无菌去离子水。
  16. 设置一个长波长紫外线灯在印刷平台上提供同步光聚合能力。
  17. 使用UV光测量紫外线强度在打印平台米。调整UV灯和打印机平台之间的距离如此的强度在打印对象是4-8之间毫瓦/厘米2（大约25厘米的灯，以在打印机平台）。

2，生物油墨的制备

  1. 单层软骨细胞扩张
    1. 板500万的人软骨细胞到每个T175组织培养瓶用于细胞扩增中的Dulbeccos改进的Eagles培养基（DMEM），补充有10％小牛血清和1x青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（PSG）。培养细胞在37℃下用含5％CO 2的加湿空气。改变培养基每3天，直到烧瓶85％汇合。从同一通道使用的细胞。
  2. 溶解PEGDA在PBS中的10％w / v的终浓度添加光引发剂I-2959的0.05％w / v的终浓度过滤灭菌的溶液中。
  3. 暂停在制备PEGDA溶液培养的人软骨细胞以5×10 6个细胞/毫升。

3，软骨组织印刷

  1. 关闭打印机和笔记本电脑上。
  2. 创建一个实心圆与直径4毫米使用Microsoft Word或Adobe Photoshop中的印刷图案。
    1. 调整图案的位置，并确保它会准确打印到塑料模具。
    2. 计算到达支架的所需厚度所需的打印数。为4毫米高度，220的打印需要创建所需的脚手架。
  3. 加载到生物油墨墨盒。盖上铝箔盒在打印过程中，以保护从直接紫外线照射。
  4. 发送打印命令到打印机。拉纸传感器，当打印机开始打印。整个印刷过程只需要不到4分钟用于直径4毫米和4毫米高支架。
  5. 转印印刷neocartilage到24孔板中并加入1.5毫升培养培养基到每个孔中。

4。细胞活性评价在3D支架

  1. 孵育印刷neocartilage在LIVE / DEAD活力/细胞毒性工作在室温下在黑暗中15分钟，溶液中。
  2. 削减了一半的细胞充满水凝胶，并采取切削区的荧光图像。
  3. 现场计数（绿色）和死（红）细胞由不知情的观察者五个随机拍摄的图像。通过将活细胞的数目由活细胞和死细胞的总数计算细胞存活率。

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结果

修改后的热喷墨打印机是能够用于细胞和支架材料沉积在高吞吐量和出色的细胞活力。与同时进行光致聚合和光敏生物材料相结合，这种技术能够以固定细胞和其他印刷物质的最初沉积的位置。根据修改后的热喷墨打印机的属性，在2D打印分辨率为300 dpi，采用130 PL单个墨滴体积。有50个发射喷嘴每个打印头与3.6 kHz的发射频率12,13。因此，对于直径4毫米和4毫米的高度，体积和各印刷层的层 ...

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讨论

这种3D生物印刷系统和同步光聚合产能提供比使用注射器挤出蜂窝海藻酸钠水凝胶16骨软骨缺损的原位印刷的最佳先前报道的方法一个显著更高的打印分辨率。较高的打印分辨率是特别关键的软骨组织工程恢复解剖软骨带状组织。层 - 层组装过程中同时进行光聚合反应是至关重要的，以维持细胞和生物材料支架的三维结构的精确沉积。微细加工与各印刷层也导致带状层之间的?...

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披露声明

作者没有任何金融利益在这项研究中。

致谢

作者要感谢来自纽约首都地区研究联盟资助的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
HP Deskjet 500 thermal inkjet printerHewlett-PackardC2106aDiscontinued. Purchased refurbished from internet vendor.
HP black ink cartridgeHewlett-Packard51626a
Ultraviolet lampUVPB-100AP
UV light meterGeneral ToolsUV513AB
Zeiss LSM 510 laser scanning microscopeCarl ZeissLSM 510
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)Mediatech10-013
Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG)Invitrogen10378-016
Accutase cell dissociation reagentInvitrogenA11105-01
Phosphate buffered saline (PBS)Invitrogen10010-023
Live/Dead viability/cytotoxicity KitInvitrogenL-3224
Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA)Glycosan BiosystemsGS700
Irgacure 2959Ciba Specialty ChemicalsI-2959
Human articular chondrocytesLonzaCC-2550

参考文献

  1. Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
  2. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
  3. Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
  4. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
  5. Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
  6. Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
  7. Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
  8. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
  9. Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
  10. Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
  11. Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
  12. Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
  13. Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
  14. Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
  15. Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
  16. Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).

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