El cartílago humano Tissue Fabrication Usando tridimensional Tecnología de impresión inyección de tinta

Resumen

Los métodos descritos en este artículo muestran cómo convertir una impresora de inyección de tinta comercial en un bioprinter con la polimerización UV simultánea. La impresora es capaz de construir la estructura del tejido 3D con células y biomateriales. El estudio ha demostrado aquí construyó un neocartílago 3D.

Resumen

Bioprinting, que se basa en la impresión de inyección de tinta térmica, es una de las más atractivas tecnologías facilitadoras en el campo de la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Con las células de control digital, andamios, y factores de crecimiento pueden ser depositados precisamente a la de dos dimensiones (2D) deseado y ubicaciones (3D) tridimensionales rápidamente. Por lo tanto, esta tecnología es un enfoque ideal para la fabricación de tejidos que imitan sus estructuras anatómicas nativas. Con el fin de diseñar el cartílago con la organización nativa zonal, composición de la matriz extracelular (ECM), y las propiedades mecánicas, hemos desarrollado una plataforma bioprinting usando una impresora de inyección de tinta comercial con fotopolimerización simultánea capaz para la ingeniería de tejido cartilaginoso 3D. Condrocitos humanos en suspensión en poli (etilenglicol) diacrilato (PEGDA) se imprimieron para la construcción neocartílago 3D mediante el conjunto de capa por capa. Las células fueron fijadas impresos en sus posiciones originales depositados, apoyado por el entorUnding andamio en la fotopolimerización simultánea. Las propiedades mecánicas del tejido impreso fueron similares al cartílago nativo. En comparación con la fabricación de tejidos convencional, que requiere la exposición a UV más larga, la viabilidad de las células impresos con fotopolimerización simultánea fue significativamente mayor. Neocartílago Impreso demostró una excelente glicosaminoglicano (GAG) y la producción de colágeno de tipo II, que era consistente con la expresión de genes. Por lo tanto, esta plataforma es ideal para la distribución de células exacta y la disposición para la ingeniería de tejidos anatómica.

Introducción

Bioprinting basa en la impresión de inyección de tinta térmica es una de las tecnologías que permiten más prometedores en el campo de la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Con cabezales de impresión de control digital y de alto rendimiento factores de células, andamios, y crecimiento pueden ser depositados precisamente a la de dos dimensiones (2D) deseado y posiciones (3D) tridimensionales rápidamente. Muchas aplicaciones exitosas se han cumplido con esta tecnología en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa ^1-9. En este trabajo, una plataforma bioprinting se estableció con una impresora Deskjet modificado Hewlett-Packard (HP) 500 térmica de inyección de tinta y un sistema de fotopolimerización simultánea. Hidrogeles sintéticos formulados a partir de poli (etilenglicol) (PEG) han mostrado la capacidad de mantener la viabilidad de los condrocitos y promover la producción de ECM condrogénica ^10,11. Además, fotorreticulable PEG es altamente soluble en agua con baja viscosidad, lo que lo hace ideal para polyme simultánearización durante bioprinting 3D. En este trabajo, los condrocitos humanos en suspensión en el poli (etileno) diacrilato (PEGDA; MW 3400) se imprimieron precisamente para construir capa-por-capa neocartílago con 1400 dpi de resolución en 3D. Se observó la distribución homogénea de células depositadas en un andamio 3D, que generó tejido de cartílago con excelentes propiedades mecánicas y la mejora de la producción de ECM. Por el contrario, en la fabricación manual de las células acumuladas en la parte inferior del gel en lugar de sus posiciones depositados inicialmente debido a la polimerización de andamio más lenta, lo que condujo a la formación de cartílago no homogénea después de la cultura ^2,3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Bioprinting Plataforma Establecimiento

La modificación de la impresora se basa en una impresora de inyección de tinta térmica HP Deskjet 500 y HP 51626A cartucho de tinta de color negro.

1. Retire la tapa de plástico encima de la impresora y cuidadosamente extraiga el panel de control de la cubierta.
2. Desconecte las conexiones de los cables entre 3 la parte superior de la impresora y la base. Quite la parte superior de la impresora desde la base.
3. En la parte superior de la impresora, retire la pequeña de plástico y accesorios de goma (sistema de limpieza del cabezal de impresión) en el lado derecho debajo del cartucho de tinta.
4. Quite la base de la bandeja de papel con resortes.
5. Retire la placa metálica que cubre la barra de alimentación de papel de plástico.
6. Cortar la barra de alimentación de papel de plástico en la posición de la rueda de alimentación medio usando una sierra de mano u otra herramienta de corte.
7. Retire las 2 ruedas de alimentación de papel expuestos después de la etapa anterior. El plástico de la rueda es muy duro y un sistema electrónicosierra será útil.
8. Limpie el polvo y los escombros de utilizar paños de aire y etanol en conserva.
9. Coloque la parte superior de la impresora a la base.
10. UV esterilizar la impresora modificado durante al menos 2 horas en una campana de flujo laminar antes de usar.
11. Cortar la tapa de un cartucho de tinta HP 51626A utilizando una sierra de mano u otra herramienta de corte.
12. Vaciar la tinta y retire el filtro que cubre el depósito del fondo del pozo del cartílago.
13. Enjuague el cartucho a fondo con agua corriente del grifo.
14. Ultrasonicate el cartucho en desionizada (DI) durante 10 min para eliminar la tinta residual.
15. Examine el cartucho para asegurarse de que toda la tinta se ha eliminado. Enjuague o rociar el cartucho a fondo con etanol al 70% para la esterilización, seguido de agua DI esterilizada.
16. Configurar una lámpara de luz ultravioleta de onda larga sobre la plataforma de impresión para proporcionar una capacidad de fotopolimerización simultánea.
17. Medir la intensidad de los rayos UV en la plataforma de impresión usando una luz UVmetro. Ajustar la distancia entre la lámpara UV y la plataforma de la impresora de modo que la intensidad de impresión en el sujeto está entre 4-8 mW / cm ² (aproximadamente 25 cm desde la lámpara a la plataforma de la impresora).

2. Preparación Bioink

1. Expansión de condrocitos monocapa
   1. Placa de 5 millones de condrocitos humanos en cada matraz de cultivo de tejido T175 para la expansión de células en Dulbecco Modificado Eagles Medium (DMEM) complementado con 10% de suero de ternera y 1x de penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG). Células de cultivo a 37 ° C con aire humidificado contiene 5% de CO _2. Cambiar el medio de cultivo cada 3 días hasta que el matraz es 85% de confluencia. Utilice células de la misma pasaje.
2. Disolver PEGDA en PBS a una concentración final de 10% w / v Añadir fotoiniciador I-2959 a una concentración final de 0,05% w / v Filtrar esterilizar la solución.
3. Suspender los condrocitos humanos cultivados en la solución PEGDA preparado a 5 x 10 ⁶ células /ml.

3. El cartílago de tejido de impresión

1. Encienda la impresora y el ordenador portátil.
2. Crear un patrón de impresión de un círculo sólido con 4 mm de diámetro utilizando Microsoft Word o Adobe Photoshop.
   1. Ajuste la posición del patrón y asegúrese de que se imprimirá exactamente en el molde de plástico.
   2. Calcular el número de copias necesarias para alcanzar el espesor deseado del andamio. Para 4 mm de altura, se requieren 220 impresiones para crear el andamio deseado.
3. Cargue el bioink en el cartucho de tinta. Cubra el cartucho con papel de aluminio para protegerlo de la exposición directa del sol durante la impresión.
4. Enviar comando de impresión a la impresora. Tire del sensor de papel cuando la impresora comienza a imprimir. El proceso de impresión de conjunto debería tomar menos de 4 minutos para un andamio con 4 mm de diámetro y 4 mm de altura.
5. Transferencia impreso neocartílago a una placa de 24 pocillos y añadir 1,5 ml de medio de cultivo a cada pocillo.

4. Evaluación de viabilidad celular en 3D Andamios

1. Incubar la neocartílago impreso en solución VIVO / DEAD viabilidad / citotoxicidad de trabajo a temperatura ambiente durante 15 min en la oscuridad.
2. Cortar el hidrogel de células cargadas por la mitad y tomar imágenes fluorescentes de la zona de corte.
3. Cuente en vivo las células muertas (rojo) (verde) y por un observador ciego a los cinco imágenes tomadas al azar. Calcular la viabilidad celular mediante la división del número de células vivas por el número total de células vivas y muertas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

La impresora de inyección de tinta térmica modificado era capaz de celular y la deposición de andamio con un alto rendimiento y una excelente viabilidad celular. La combinación con la fotopolimerización simultánea y biomateriales fotosensibles, esta tecnología es capaz de fijar las células y otras sustancias impresos a los lugares depositados inicialmente. De acuerdo con las propiedades de la impresora de inyección de tinta térmica modificada, la resolución de impresión de 300 dpi 2D con un solo volumen de g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Este sistema bioprinting 3D con capacidad de fotopolimerización simultánea proporciona una significativamente mayor resolución de impresión que el mejor método descrito de esta en la impresión in situ de los defectos osteocondrales utilizando jeringa extruido un hidrogel de alginato celular ^16. Una mayor resolución de impresión es particularmente crítico para la ingeniería de tejidos de cartílago para restaurar la organización zonal cartílago anatómica. Fotopolimerización simu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HP Deskjet 500 thermal inkjet printer	Hewlett-Packard	C2106a	Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor.
HP black ink cartridge	Hewlett-Packard	51626a
Ultraviolet lamp	UVP	B-100AP
UV light meter	General Tools	UV513AB
Zeiss LSM 510 laser scanning microscope	Carl Zeiss	LSM 510
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)	Mediatech	10-013
Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG)	Invitrogen	10378-016
Accutase cell dissociation reagent	Invitrogen	A11105-01
Phosphate buffered saline (PBS)	Invitrogen	10010-023
Live/Dead viability/cytotoxicity Kit	Invitrogen	L-3224
Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA)	Glycosan Biosystems	GS700
Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals	I-2959
Human articular chondrocytes	Lonza	CC-2550