初级量子神经元轴突运输的实时成像点标记的BDNF

摘要

BDNF，神经营养因子，对轴突运输是几个神经元群体的生存和功能是至关重要的。一些退行性疾病的标志是轴索结构和功能的破坏。我们展示了用于检查QD-BDNF在使用初级神经元微流控室现场贩卖的技术。

摘要

BDNF在神经元存活，分化和功能的若干方面具有重要作用。结构和功能的缺陷在轴突日益被看作神经变性疾病，包括阿尔茨海默氏病（AD）和亨廷顿病（HD）的早期特征。尚不清楚是由轴索损伤诱导机制（S）。我们报道了一种新技术的发展，以产生具有生物活性，monobiotinylated BDNF（mBtBDNF），可以用来跟踪BDNF的轴突运输。量子点标记的BDNF（QD-BDNF）是由共轭量子点655到mBtBDNF制备。一种微流体装置被用于分离从神经元胞体的轴突。除了QD-BDNF的到轴突舱允许的BDNF运输轴突的实时成像。我们证明了QD-BDNF的移动基本上是完全逆行，除了极少数停顿，约为1.06微米/秒的移动速度。此系统可用于研究我的破坏轴突功能在AD或HD，以及其他退行性疾病chanisms。

引言

神经元是高度分化的细胞，其长，通常高度阐述的过程是基本建立和保持神经回路的结构和功能。轴突起着运载的货物和从突触至关重要的作用。蛋白质和细胞器的细胞胞体合成需要通过轴突运输到达突触前末梢，支持神经元功能。相应地，接收的信号在远端轴突需要被转并输送到体细胞。这些方法可用于神经元的存活，分化和维持所必需的。在某些神经元的轴突运输必须通过的距离超过1000倍的细胞体的直径进行，有可能容易地预想到，即使是很小的缺陷可显着影响神经元和电路功能。

脑源性神经营养因子（BDNF），生长因子的神经营养因子家族中的一员，是目前在马纽约州的大脑区域，包括海马，大脑皮层和基底前脑。 BDNF起着认知和记忆的形成所配套的存活，分化，并参与认知神经回路的功能至关重要的作用。 BDNF结合到其受体的酪氨酸激酶受体TrkB，在轴突终端那里它激活的TrkB介导的信号传导途径，包括有丝分裂原激活的蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶（MAPK / ERK），磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和磷脂酶C-γ（PLCγ）。在参与这些信号传导途径的蛋白被包装到内吞囊泡结构，以形成BDNF / TrkB的信令内体^1-6被再逆行转运到神经元胞体。

微流体培养室是研究在正常条件下，以及在损伤和疾病^7,8的设定轴突生物学一个非常有用的平台。通过隔离轴突从细胞体，该装置允许一个具体研究运输中的轴突^8-10。在与在该研究中使用450微米的微沟槽屏障基于PDMS的微流体平台进行商业购买（参见材料表）。为了研究BDNF的运输，我们开发了一种新的技术，生产monobiotinylated BDNF（mBtBDNF）。我们把生物素受体肽，美联社（又称重组蛋白质）的优势。它是一个包含一个赖氨酸残基，可以由大肠杆菌酶的生物素连接酶，BirA的具体连接到生物素15的氨基酸序列。我们融合的重组蛋白质的小鼠预先proBDNF基因的C末端，通过PCR（ 图1A）。该构建体被克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1 myc基因-His载体。我们还克隆的细菌BirA的DNA导入的pcDNA3.1 myc基因-His载体。两个质粒瞬时共转染到HEK293FT细胞表达两种蛋白。 BirA的催化毕结扎在具体的赖氨酸驻留在重组蛋白质中的BDNF的在1的C末端:1的比例以产生monobiotinylated BDNF单体。生物素化的，成熟的BDNF与〜18kDa的分子质量，回收和使用的Ni-树脂（ 图1C）的介质纯化。 BDNF的生物素化是完全的，作为判断无法通过免疫印迹法（ 图1D），以检测未修饰BDNF。链霉亲和共轭量子点，量子点655，分别用来标明mBtBDNF使QD-BDNF。的重组蛋白质的存在下不与BDNF的活性干扰作为mBtBDNF能够激活磷酸化的TrkB（ 图1E）和刺激神经 ​​突向外生长（ 图1F），以重组人BDNF（rhBDNF）的程度。免疫组化显示，QD-BDNF共定位与TrkB的海马神经轴突，表明QD-BDNF的生物活性（ 图1G）。研究了BDNF的运输，QD-BDNF加入到远端轴突隔室含E18大鼠海马神经元（ 图2A）微流控文化。在轴突QD-BDNF逆行运输被抓获的红色荧光标记（ 支持视频S1，S2）的实时现场图像。通过分析所产生的kymograph，QD-BDNF的观察可以在约1.06微米/秒（ 图3A）的移动速度逆向转移。 GFP或mCherry-标记的BDNF已被用于跟踪BDNF的神经轴突的运动。主要的缺点是，他们不是为单个分子的研究不够明亮。另外，无论是顺行性与逆行BDNF运动的存在使得难以评估的逆向转移BDNF是否是一种神经营养蛋白/受体复合体。

在这段视频中，我们展示了用于检查QD-BDNF在利用原代神经元的微流控室现场贩卖的技术。该ultrabrightness和量子点麦出色的耐光性ES能够进行BDNF传输的长期跟踪。这些技术可被利用来提高AD中，HD和其他神经变性疾病的轴突功能的研究。

研究方案

手术和动物的程序进行了严格按照美国国立卫生研究院指南的护理和使用实验动物。所有涉及使用动物实验是由加州大学圣地亚哥分校机构动物照顾及使用委员会批准。

1质粒的克隆，单生物素BDNF的表达和纯化（mBtBDNF）

注:建设前期proBDNFavi和BirA的cDNA插入在HEK293FT细胞¹⁰ pcDNA3.1载体和共表达。使用Ni-NTA珠根据生产成熟的和生物活性monobiotinylated神经生长因子^{（mBtNGF）10}的先前公布的方法mBtBDNF纯化。

2，制备微流控商会

微流体神经元培养装置，能够使流体流动的隔离神经元胞体的轴突。每个解剖前集会权与新涂盖玻片室。用于微流控室在这个协议是商业购买（见材料和​​设备的表）。手洗和重复购买商业腔高达5-6x。

1. 手洗的1％Alconox清洁剂的微流控室。漂洗三次，用Milli-Q水用于各30分钟。再次手洗室70％的乙醇。
2. 铺陈室晾干的封口膜的层流罩。辐射灭菌的腔两侧紫外光下20分钟。存放在无菌15cm培养皿在室温下用石蜡膜密封消毒室。
3. 将24×40mm的1号盖玻片在玻璃容器中。浸泡过夜旋转器上在35％盐酸盖玻片。在第二天，冲洗盖玻片三次，每次加水30分钟。
4. 浸渍每个盖玻片到100％的乙醇和燃烧过本生灯消毒盖玻片一个接一个。储存干盖玻片在无菌培养皿中，并保持在室温下直至涂层。
5. 莱OU吨，15厘米的培养皿中的盖玻片。外套每个盖玻片用0.7ml的0.01％的聚-L-赖氨酸（PLL），并培育在通风橱中在室温下进行。
6. 1小时后，冲洗盖玻片三次，用无菌水。干盖玻片真空和地方每个盖玻片成一块2.4英寸的培养皿。
7. 组装微流体室中，放置与微沟槽侧的腔室的底部上的PLL涂覆的盖玻片小心不要接触到微槽。轻轻按下室用枪头，以确保室内进行密封。

3，神经解剖文化和板块上庭

1. 放置两个E17-E18大鼠海马（一个脑）解剖在15ml锥形管中含2ml夹层缓冲液（HBSS，无钙无镁，用1％青霉素/链霉素和10mM HEPES。冲洗组织3倍用5ml每次清扫缓冲拆下清扫缓冲尽可能并添加900微升新鲜二ssection缓冲区。
2. 消化组织，加入100μl的10X胰蛋白酶（2.5％）进夹层缓冲，使1个工作浓度。放置锥形管在37℃水浴。消化后的10分钟，加入100μl的10毫克/毫升的DNase I至约1毫克/毫升的最终浓度。
3. 用火抛光的巴斯德玻璃吸管，轻轻地上下吹打5到10倍磨碎的组织。研磨后右，淬火用2ml平板培养基（神经基础有10％FBS，2mM的Glutamax的，2％B27）的胰蛋白酶。
4. 留在引擎盖样品5分钟，使组织中的任何碎片落户到了谷底。小心地取出2毫升上清液倒入干净无菌的15毫升锥形管中，离心分离机，在200×g离心5分钟以沉淀细胞。悬浮颗粒在50微升电镀媒体
5. 计数细胞与血球。负载15-20微升细胞悬浮液（〜40,000个细胞）到微流体室中的一个隔室。放置室在培养箱中培养10分钟，以使细胞附着在盖玻片上。 10分钟后，加入更多的镀介质来填充该腔室的两个室。
6. 对解剖的第二天，完全（有2mM Glutamax的，2％B27的Neurobasal）在两个细胞体和轴突隔室更换电镀媒体与维护媒体。从海马神经元的轴突开始穿越微槽3天，达到5-7天之间的轴突舱。在这段时间内，用新鲜维持培养基，每24〜48小时，更换一半的培养介质。

QD-BDNF的4轴突运输

1. 之前住QD-BDNF的轴突运输的成像，从微流体室中的两个细胞体和轴突隔室耗尽BDNF通过彻底冲洗两个室用BDNF无，无血清的Neurobasal介质，每30分钟2小时。
2. 在BDNF的枯竭，准备QD-BDNF的结合物。搭配50纳米的单生物素化的BDNF二聚体用50nM的Neurobasal介质QD655-链霉抗生物共轭物和在冰上孵育60分钟。
3. 在轴突舱取出介质，加入300μlQD-BDNF 0.25纳米的终浓度为4小时，在37℃。为了尽量减少QD-BDNF的漫射到细胞体隔室，这是很重要的，以始终保持介质中的细胞体隔室更高的水平比在轴突隔室。前实时成像孵育后洗去未结合的QD-BDNF。
4. 使用倒置显微镜配有100X油物镜进行QD-BDNF运输的实时成像。预热的范围和附加到它的恒定温度（37℃）和CO _2（5％）的环境室中。使用一组德克萨斯红的激发/发射的多维数据集可视化的QD655信号。
5. 获取和捕捉中间的轴突内的延时图像1帧/秒的速度，总共2分钟使用CCD摄像头。使用细微沟槽，无轴突塔吨有没有量子点，因此没有信号的渗透控制。
6. 分析使用任何图像分析软件或NIH ImageJ的BDNF的运输。

结果

生产具有生物活性的单 - 生物素化的BDNF的纯化

BDNF的稠合有一个重组蛋白质序列（GGGLNDIFEAQKIEWHE）的表达载体，根据以前发表的协议¹⁰创建。全长融合蛋白的分子质量预测为〜32kDa的（ http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ）Monobiotinylated成熟的BDNF为18 kDa的（ 图1A）的预测分子量制作在HEK293FT细胞和纯化的条件培?...

讨论

在这项研究中，我们报道了一种新技术的发展，以产生具有生物活性，monobiotinylated BDNF（mBtBDNF），可以用来跟踪BDNF的轴突运输。通过缀合的蛋白质，以量子点的链霉亲和使用的微流体腔室，该方法允许一个检测BDNF在与单个分子的灵敏度，在实时的和具有空间分辨率和时间分辨率原代神经元的轴突运输。这里所使用的工具提供了由研究介导的BDNF / TrkB的信号内吞体的健康和疾病的神经元轴突运输?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Platinum pfx DNA polymerase	Invitrogen	11708021
EcoRI	Fermentas	FD0274
BamHI	Fermentas	FD0054
HEK293FT cells	Invitrogen	R70007
DMEM-high glucose media	Mediatech	10-013-CV
D-biotin	Sigma	B4639
TurboFect	Fermentas	R0531
PMSF	Sigma	P7626
Aprotinin	Sigma	A6279
Ni-NTA resins	Qiagen	30250
Protease inhibitors cocktail	Sigma	S8820
Silver staining kit	G-Biosciences	786-30
Human recombinant BDNF	Genentech
Microfluidic chambers	Xona	SND450
24 x 40 mm No. 1 glass coverslips	VWR	48393-060
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
HBSS	Gibco	14185-052
DNase I	Roche	10104159001
Trypsin	Gibco	15090-046
Neurobasal	Gibco	21103-049
FBS	Invitrogen	16000-044
GlutaMax	Invitrogen	35050-061
B27	Gibco	17504-044
QD655-streptavidin conjugates	Invitrogen	Q10121MP
anti-Avi tag antibody	GenScript	A00674
streptavidin-agarose beads	Life Technology	SA100-04
Trichloroacetic acid	Sigma	T6399
HRP-streptavidin	Thermo Scientific	N100
anti-pTrkB antibody	a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody	BD Science	610101