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摘要

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

摘要

器官型培养允许它模仿功能和其在体内的组织对应的生理3D环境进行细胞-细胞接触和细胞-基质相互作用至关重要的重构。这是通过皮肤器官培养忠实地概括了表皮分化和分层方案例证。原代人表皮角质形成细胞是通过逆转录病毒基因在那里可以很容易地过度表达或撞倒的基因操纵。这些遗传修饰的角质形成细胞随后可以用来再生人表皮在器官型培养物的皮肤提供了强大的模型来研究遗传途径冲击表皮生长，分化和疾病进展。这里介绍的协议描述方法以制备灭活人真皮以及遗传操作初级人角质形成细胞，以便产生皮肤器官培养物。再生人体皮肤可downstr使用EAM的应用，如基因表达分析，免疫染色，和染色质免疫沉淀，随后通过高通量测序。因此，这些代转基因器官皮肤培养物将允许基因是保持皮肤稳态的关键的确定。

引言

人类表皮是一个分层上皮，它可通过细胞外基质被称为基底膜zone.The表皮不仅作为不可渗透的屏障，以防止水分的损失，而且作为防御的第一道防线，以保护连接到下面的真皮身体从国外和有毒物质1。基底层，这是表皮的最深处层，包含表皮干细胞和祖细胞的产生的已分化后代，形成了表皮2的其余部分。表皮祖细胞分化它们迁移向上，以形成被称为棘层3分化的细胞的第一层。在棘层，细胞打开角蛋白1和10的表达，其然后提供强度来承受物理应力为表皮的分化层。作为棘层细胞进一步分化，它们向上移动在表皮为米颗粒层其特征是，形成的透明角质和片状颗粒以及其组装下面质膜结构蛋白。随着细胞继续在分化过程中，质膜下方的蛋白质交联到对方，而层状颗粒从细胞挤出 ​​，以形成富含脂质屏障称为角质层4。

疾病涉及在表皮生长和分化的影响〜人口5的20％的改变。因此，了解该方法的机制是非常重要的。因为许多这些疾病的表现是在细胞-细胞或细胞-基质接触队伍，器官型培养其中人表皮复原在3D环境中已创建6-10。这些方法通常包括使用接种在细胞外基质的主要或转化角化细胞如失活的人类的真皮层，基质胶或胶原蛋白。

要明白，在表皮生长和分化的重要的基因调控机制，角化细胞可以遗传通过逆转录病毒载体操纵以拦截或过表达的基因在二维培养，然后在三维重构。这些方法已被广泛用于表征涉及表皮干细胞和祖细胞的自我更新和分化以及进展为肿瘤11-21基因。这里，提供了深入协议，关于如何通过利用逆转录病毒的改变在表皮器官型培养的基因表达。

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研究方案

根据加州大学圣迭戈分校的研究伦理委员会的指导方针进行了人体皮肤的协议。人的皮肤可以从废弃的手术样本中获得，或从皮肤银行购买（皮肤银行被列在材料/设备表 ）。其中皮肤是从主或施主的年龄衍生的位置不是本实验只要基底膜区蛋白（胶原蛋白/层粘连蛋白）在真皮临界不会降解。

1.准备失活的人真皮的

  1. 在接收到人体皮肤时，将组织在组织培养罩解冻（〜3-5分钟）。根据皮肤的大小，放置解冻组织在一个无菌的一次性50ml锥形管或125毫升瓶装。从皮肤银行皮肤的典型大小为0.75平方英尺。
  2. 填充容器75％满，支持4倍青霉素和链霉素（笔/链球菌）的1X PBS。剧烈摇晃5分钟和处置的液体。重复此步骤3次以上。
  3. 在最后一次洗涤后，将组织转移到新的试管/瓶，加上新的4倍青霉素/链霉素/ PBS中以填充容器的75％。孵育在组织培养箱此混合物在37℃下进行2周，以允许从表皮真皮的分离。
  4. 在无菌条件下，使用镊子剥离表皮从真皮。真皮是全白，而表皮会有着色根据供体（ 图1A）的比赛。根据该机构的协议处理人体组织丢弃表皮。
  5. 将在管或瓶真皮和4倍笔/链球菌稀释于1×PBS中剧烈振荡（5分钟洗4次）清洗。在最后一次洗涤后，将真皮转移到新的试管/瓶在4倍青霉素/链霉素稀释于1×PBS中，并储存在4℃直至准备使用。真皮可以储存在4℃下长达一年。

2.遗传修饰小学的人角质形成细胞

注:生长在完全DMEM培养基[DMEM + 10％胎牛血清（FBS）+青霉素/链霉素]，制造病毒感染的原代人角质形成细胞用嗜凤细胞。病毒包装基因编码蛋白质如的gag-pol和信封被稳定地整合到凤细胞基因组中时，用逆转录病毒载体转染其允许病毒的生产。凤凰细胞可被转染的高效率，可用于高病毒效价的生产。从这个包装线生产的病毒也可以感染多种哺乳动物细胞，包括人。

  1. 第1天:转染前一天，种子凤细胞在6孔板中以每孔80万细胞在完全DMEM培养基中的密度。
  2. 第2天:转染的当天，用3微克的逆转录病毒载体的每孔。等分试样3微克逆转录病毒载体导入1.5ml试管。使用100μ组合;升的DMEM加6微升转染试剂的每3微克载体的构建。拌6微升转染试剂用在1.5ml管100微升DMEM中。 （对所使用的逆转录病毒载体中列出的设备/材料表）。
    1. 孵育5分钟，并添加106微升混合物到预等分管含有3微克的逆转录病毒载体的构建。混合并在室温下孵育30分钟。添加这种混合物全部滴凤凰细胞的每一个孔。
  3. 第3天:转染后的第二天，从凤凰细胞取出媒体和加入2毫升新鲜完整的DMEM培养基。在同一天，种子初级人角质形成细胞到6孔板中，每孔75000个细胞的密度。保持在角质形成细胞无血清培养基（KCSFM）抗生素（青霉素/链霉素）的角质形成细胞。
    注:原代人角质形成细胞购买。细胞可以从多家供应商（在材料/设备表中列出）购买。
  4. 第4天:HAR从转染的凤细胞，其现在包含病毒颗粒归属介质。通过使用注射器0.45μm的过滤器传递介质（以除去任何污染的凤细胞），并放置2 ml的到角质形成细胞（前一天接种在75000个细胞/孔:参见步骤2.3）。加入聚凝胺（5微克/毫升）向媒体帮助调解感染过程。病毒滴度是〜1×10 7 TU /毫升。
    1. 旋6孔板在离心机中，在200×g离心1小时，在室温。旋转后，取出含有病毒的媒体和添加KCSFM前，用1×PBS洗一次细胞。
  5. 第5天:感染同一批次的角质形成细胞的再按照步骤2.4。
    注意:选择使用药物的角化细胞是否存在的逆转录病毒载体的选择标记和扩大用于下游分析或应用，例如器官型培养使用。

3.设置器官皮肤文化

  1. 构建从实验室中常用的材料或盒录像带器官可以通过金属加工店进行定制（ 图2A - F）。从3.5厘米组织培养板使这些磁带盒，使用烧灼来从一个3.5厘米培养皿（ 图2A-B）的盖子的中心除去1.0厘米×1.0厘米的正方形。为此无菌条件下。
    1. 附加方形栓用透明指甲油（ 图2C）纸盒（3.5 cm培养皿的盖子）的底部。允许5分钟的指甲油干，翻转磁带上，使其搁在方形栓（ 图2D）。放置盒插入直径6cm培养皿。
      注:方形栓可以从各种手工艺品商店购买。
  2. 制备角质形成细胞生长培养基（KGM）由66％的DMEM，22％的Ham的F12，100单位/毫升青霉素，100微克/ ml链霉素，10％FBS，2.67微克/毫升腺嘌呤，40 N克/ ml氢化可的松，10纳克/毫升的霍乱毒素，4.94微克/毫升的胰岛素，5微克/毫升转铁蛋白，1.36纳克/毫升三碘左旋甲腺氨酸，10纳克/毫升的EGF，和10微克/毫升盐酸环丙沙​​星。用0.22微米的过滤和储存过滤介质在4°C，直到准备使用。
  3. 取真皮出在4x青霉素/链霉素+ PBS溶液和在KGM中洗2次，然后孵育在KGM中，在37℃下在使用前两天。
  4. 切割用手术刀真皮至1.5厘米×1.5厘米大小的块，然后放置到器官盒。放置真皮朝上真皮的顶部。真皮的顶部将是进入与角质形成细胞（ 图1B）接触的一侧。
  5. 将预切真皮到器官盒朝上（图3A）的真皮的顶侧的方孔。
  6. 翻转整个器官盒含有真皮过使用镊子（图3B）。冰上解冻的细胞外基质的解决方案。使用针头和注射器绘制出100微升每盒细胞外基质的解决方案。加入5滴到真皮（光面）的底部，并轻微振荡以确保整个真皮（图3B）的均匀分布。
  7. 允许用于商业细胞外基质溶液5分钟后，完全固化（图3C）。凝固后，使用镊子翻动录像带回去。添加4毫升KGM到直径6cm培养皿。
  8. 放置0.5-1百万遗传修饰的角质形成细胞在含有真皮（图3D）的器官型盒。
    1. Trypsinize角化细胞通过将4 ml的0.05％胰蛋白酶的10个到厘米板5分钟，骤冷用4ml完全DMEM介质。
    2. 计数使用血球的角化细胞，然后降速，在200×g离心5分钟。重悬0.5-1百万个细胞在90μ（取决于可用的细胞数）升KGM和放置所有单元格到真皮层。
      注意:它放置细胞相同数量的上真皮同样的实验中，以确保出现在再生表皮的厚度的任何差异不是由于在初始细胞数的差异是很重要的。在真皮层放置少于0.5万个细胞可导致分层穷人和分化。
  9. 隔日变化对器官文化KGM媒体。嘉实组织对真皮的角质形成细胞放置后1-14天。表皮完整的分层和分化通常在5天后发生。

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结果

在产生器官型人皮肤的第一步是从真皮除去表皮。皮肤在37℃下在4×青霉素/链霉素/ PBS两周孵化应该允许真皮从表皮（图1A）的分离。如果分离表皮和真皮层，很难然后将组织在37℃于4笔/链球菌/ PBS一个星期，然后再次尝试剥离使用镊子。

一个关键的灭活真皮再生人表皮的是，确保了角质形成细胞被放置在真皮的正确的一面。真皮具有顶部和底部。真皮的顶部是?...

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讨论

遗传操作在人皮肤器官型培养提供许多优点常用研究2D培养细胞以及小鼠模型。 2D培养缺乏完整的组织和器官中发现的三维细胞 - 细胞和细胞 - 细胞外基质相互作用。最近的研究还发现，与三维培养的细胞显示多基因表达的相似性对原代人皮肤肿瘤16的二维和三维培养的皮肤癌细胞之间的巨大差异。人体器官皮肤的文化也有过小鼠模型的几个优点。小鼠模型是耗时且昂贵的产生以及人类和?...

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披露声明

We have nothing to disclose.

致谢

这项工作是supportedby美国癌症协会的研究学者格兰特（RSG-12-148-01-DDC）和CIRM基础生物学奖（RB4-05779）。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Human skinNew York Firefighters Skin Bankhttp://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREPGIBCO15140-122
amphotropic phoenix cell linesATCCCRL-3213
FUGENE 6 transfection reagentPromegaE2691
Keratinocyte Media (KCSFM)Life Technologies17005042
DMEMGIBCO11995
Ham's F12Cambrex12-615F
FBSGIBCO10437-028
AdenineSigmaA-9795
Cholera ToxinSigma C-8052
HydrocortisoneCalbiochem3896
InsulinSigmaI-1882
EGFInvitrogen13247-051
Transferrin SigmaT-0665
Ciprofloxacin HydrochlorideSerologicals89-001-1
cauteryBovie Medical CorporationAA01
MatrigelCorning354234
Keratin 1 antibodyBiolegendPRB-149P
square pegsArts and crafts stores
human neonatal keratinocytesATCCPCS-200-010
human neonatal keratinocytesCell Applications102K-05n
MSCV retroviral vectorClontech634401
LZRS retroviral vectorAddgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vectorOligoengineVEC-PRT-0002 
hexadimethrine bromide SigmaH9268-5G

参考文献

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