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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Zusammenfassung

Organotypischen Kulturen erlauben die Rekonstruktion eines 3D-Umgebung kritisch für Zell-Zell-Kontakt und Zell-Matrix-Wechselwirkungen, die die Funktion und Physiologie ihrer in vivo Gewebegegen nachahmt. Dies wird durch organotypische Hautkulturen, die treu rekapituliert die epidermale Differenzierung und Stratifizierung Programm veranschaulicht. Primären humanen epidermalen Keratinozyten sind genetisch manipulierbar durch Retroviren, wo Gene lassen sich überexprimiert oder abgerissen werden. Diese genetisch veränderte Keratinozyten kann dann verwendet werden, um die menschliche Epidermis in organotypischen Hautkulturen Bereitstellung einer leistungsfähiges Modell zu genetischen Signalwege zu untersuchen aufprall epidermalen Wachstums, Differenzierung und Fortschreiten der Krankheit zu regenerieren. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben Verfahren zur devitalized menschlichen Dermis vorzubereiten sowie genetisch zu manipulieren primären humanen Keratinozyten, um organotypischen Hautkulturen zu erzeugen. Regeneriert die menschliche Haut kann in downstr verwendet werdeneam Anwendungen wie Genexpressionsanalysen, Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation, gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung. So wird Generation dieser gentechnisch veränderten organotypischen Hautkulturen der Bestimmung von Genen, die für die Aufrechterhaltung der Homöostase der Haut sind zu ermöglichen.

Einleitung

Die menschliche Epidermis ist eine geschichtete Epithel, die zu der darunter liegenden Dermis durch eine extrazelluläre Matrix, wie die Basalmembran Zone Epidermis nicht nur als Barriere, um den Verlust von Feuchtigkeit zu verhindern, sondern auch als erste Verteidigungslinie, um die zu schützen dient bekannt verbindet Körper vor fremden und toxische Stoffe 1. Die basale Schicht, die der tiefsten Schicht der Epidermis ist, enthält die epidermalen Stammzellen und Vorläuferzellen, die zu dem differenzierten Nachkommen, die den Rest der Oberhaut 2 zu bilden ergeben. Der epidermale Stammzellen differenzieren sie sich nach oben zu wandern, um die erste Schicht von differenzierten Zellen wie spinosus Schicht 3 bekannt ist. Im Stratum spinosum, drehen Zellen auf die Expression der Keratine 1 und 10, die dann liefern die Kraft, körperliche Belastung für den differenzierten Schichten der Epidermis zu widerstehen. Da die Dornfortsätze Schicht-Zellen weiter zu differenzieren, nach oben in der Epidermis, um sie zu bewegenm die Körnerschicht, die durch die Bildung von Keratohyalin und lamellarem Granulate sowie Strukturproteine, die unterhalb der Plasmamembran montiert sind charakterisiert ist. Da die Zellen in dem Differenzierungsprozess fortzufahren, die Proteine ​​unter der Plasmamembran sind Quer miteinander verbunden, während die plättchenförmigen Körnchen werden aus den Zellen extrudiert, um eine lipidreiche Barriere genannt Stratum corneum 4 bilden.

Erkrankungen, die Störungen der epidermalen Wachstums und der Differenzierung Schlag ~ 20% der Bevölkerung 5 einzubeziehen. Somit Verständnis der Mechanismen bei diesem Verfahren ist von großer Bedeutung. Da Manifestation viele dieser Krankheiten abhängig Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Kontakt haben organotypischen Kulturen, in denen die menschliche Epidermis in einer 3D Umgebung rekonstituiert 6-10 erstellt. Diese Verfahren beinhalten typischerweise die Verwendung von primären oder transformierte Keratinozyten auf der extrazellulären Matrix ausgesät wie devitalisierten menschlichenDermis, Matrigel oder Kollagen.

Gen-Regulationsmechanismen, die in den epidermalen Wachstums und der Differenzierung wichtig zu verstehen, können Keratinozyten genetisch durch retrovirale Vektoren manipuliert den Zuschlag oder überexprimieren Gene in 2D-Kultur und dann in 3D rekonstituiert. Diese Methoden sind sehr häufig benutzt worden, um Gene in epidermalen Stammzellen und Progenitorzellen Selbsterneuerung und Differenzierung sowie Progression Neoplasie 11-21 beteiligt charakterisieren. Hier eine eingehende Protokoll, wie die Genexpression in der Epidermis organotypischen Kulturen durch den Einsatz von Retroviren zu ändern ist.

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Protokoll

Die menschliche Haut-Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of California, Forschungsethikkommission von San Diego durchgeführt. Die menschliche Haut kann aus gebrauchten chirurgischen Proben erhalten oder von Hautbanken kauften (Hautbank in der Material / Ausrüstung Tabelle aufgeführt sind) werden. Der Ort, wo die Haut vor oder Alter des Spenders abgeleitet ist nicht kritisch für das Experiment, solange die Basalmembran-Proteinen (Kollagen / Laminin) in der Dermis nicht verschlechtert werden.

1. Herstellung von devitalisierten Menschen Dermis

  1. Auf der menschlichen Haut empfangen, legen Sie das Gewebe in der Gewebekultur Haube zu tauen (~ 3-5 min). Abhängig von der Größe der Haut die aufgetauten Gewebe in einem sterilen Wegwerf 50 ml konischen Röhrchen oder 125 ml Flasche. Die typische Größe der Haut von der Haut Bank 0,75 Quadratmetern.
  2. Füllen Sie den Behälter zu 75% voll mit 4x Penicillin und Streptomycin (Pen / Strep) in 1x PBS. Kräftig schütteln5 Minuten und entsorgen Sie die Flüssigkeit. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 weitere Male.
  3. Nach dem letzten Wasch, übertragen das Gewebe in ein neues Röhrchen / Flasche und fügen frische 4x Pen / Strep / PBS auf 75% des Behälters zu füllen. Inkubieren dieser Mischung in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C für 2 Wochen, um die Trennung der Dermis von der Epidermis zu ermöglichen.
  4. Unter sterilen Bedingungen verwenden Pinzette von der Dermis abziehen die Epidermis. Die Dermis vollständig weiß ist, während die Epidermis wird Färbung in Abhängigkeit von der Rasse des Spenders (1A) haben. Entsorgen Sie die Haut gemäß dem Protokoll des Instituts für den Umgang mit menschlichem Gewebe.
  5. Legen Sie die Dermis in einer Tube oder Flasche und waschen Sie ihn in 4x Pen / Strep in 1x PBS unter kräftigem Schütteln verdünnt (5 min wäscht 4 mal). Nach dem letzten Wasch, übertragen Sie die Dermis in ein neues Röhrchen / Flasche in 4x Pen / Strep in 1x PBS verdünnt und bei 4 ° C bis zur Verwendung. Dermis können bei 4 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden.

2. genetische Modifizierung primären humanen Keratinozyten

HINWEIS: Verwenden Sie amphotrope phoenix Zellen in vollständigem DMEM media [DMEM + 10% fötalem Rinderserum (FBS) + Pen / Strep] gewachsen, um Viren zu produzieren, um primäre menschliche Keratinozyten zu infizieren. Virale Verpackungs Gene, die Proteine ​​wie gag-pol und Umschlag kodieren, stabil in das Zellgenom Phoenix die für die Virusproduktion ermöglicht, wenn sie mit einem retroviralen Vektor transfiziert integriert. Phoenix-Zellen mit hoher Effizienz unter Berücksichtigung hoher Virustiter Produktions transfiziert werden. Virus von dieser Verpackungslinie produziert kann auch infizieren eine Vielzahl von Säugetierzellen einschließlich menschlicher.

  1. Tag 1: Am Tag vor der Transfektion seed Phoenix-Zellen in einer Platte mit 6 Vertiefungen in einer Dichte von 800.000 Zellen pro Vertiefung in komplettem DMEM Medium.
  2. Tag 2: Tag der Transfektion, verwenden Sie 3 ug von retroviralen Vektoren pro Vertiefung. Aliquot 3 ug retroviralen Vektor in einem 1,5-ml-Röhrchen. Verwenden Sie eine Mischung von 100 μ; l DMEM plus 6 ul Transfektionsreagenz für jeweils 3 ug Vektor. MIX 6 ul Transfektionsreagenz mit 100 ul DMEM in einem 1,5-ml-Röhrchen. (Die retroviralen Vektoren, die verwendet werden, sind in der Geräte / Materialien Tabelle aufgeführt).
    1. Inkubation für 5 min und fügen Sie die 106 & mgr; l-Gemisch in die Pre-aliquotierten Röhrchen mit dem 3 ug retroviralen Vektor. Mischen und Inkubation bei RT für 30 min. Fügen Sie diese gesamte Mischung tropfenweise zu jeder Vertiefung der Phoenix-Zellen.
  3. 3. Tag: Der Tag nach der Transfektion, entfernen Sie die Medien aus den Phoenix-Zellen und 2 ml frisches vollständiges DMEM-Medium. Am selben Tag, Samen primärer menschlicher Keratinozyten in 6-Well-Platten in einer Dichte von 75.000 Zellen pro Vertiefung. Pflegen Sie die Keratinozyten in einer Keratinozyten-serumfreiem Medium (KCSFM) mit Antibiotika (Pen / Strep).
    HINWEIS: Primäre menschliche Keratinozyten wurden gekauft. Zellen können aus einer Vielzahl von Anbietern (in der Material / Ausrüstung Tabelle aufgeführt) erworben werden.
  4. Tag 4: HarWeste das Medium aus den transfizierten phoenix-Zellen, die jetzt enthält Viruspartikel. Führen Sie das Material durch ein 0,45 um-Filter mit einer Spritze (um alle verunreinigenden phoenix Zellen zu entfernen) und legen Sie 2 ml auf die Keratinozyten (bei 75.000 Zellen / gut am Vortag: siehe Schritt 2.3). In Hexadimethrinbromid (5 ug / ml) zu den Medien zu helfen, vermitteln die Infektionsprozess. Virustiter sind ~ 1 x 10 & sup7; TU / ml.
    1. Drehen die Platten mit 6 Vertiefungen in einer Zentrifuge bei 200 × g für 1 h bei RT. Nach dem Spin, entfernen Sie die Medien-Virus enthält, und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS vor der Zugabe KCSFM.
  5. Tag 5: Infizieren derselben Charge von Keratinozyten wieder wie in Schritt 2.4.
    HINWEIS: Wählen Sie die Keratinozyten mit einem Medikament, wenn es einen selektierbaren Marker auf dem retroviralen Vektor und erweitern für den Einsatz in nachgelagerten Analyse oder Anwendungen wie organotypischen Kulturen.

3. Einrichten Organotypische Hautkulturen

  1. Bauen Sie dieorganotypischen Kassette aus gängigen Materialien im Labor festgestellt oder die Kassetten können benutzerdefinierte durch einen Metall Stanzerei gemacht werden (2A - F). Um diese Kassetten von einem 3,5 cm-Gewebekulturplatte zu machen, verwenden Sie ein Brenneisen, ein 1,0 cm x 1,0 cm im Quadrat aus der Mitte des Deckels aus einem 3,5 cm-Schale (2A-B) zu entfernen. Tun Sie dies unter sterilen Bedingungen.
    1. Bringen quadratischen Zapfen an der Unterseite der Kassette (Deckel 3,5 cm Schale) mit klarem Nagellack (2C). Lassen Sie 5 Minuten für den Nagellack zu trocknen und drehen Sie die Kassette auf, so dass es auf den quadratischen Zapfen (2D) ruht. Setzen Sie die Kassette in einen 6 cm Schale.
      HINWEIS: Square Pegs können aus einer Vielzahl von Kunsthandwerk-Läden gekauft werden.
  2. Vorbereitung Keratinozyten-Wachstumsmedium (KGM) von 66% DMEM, 22% Ham-F12, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10% FBS, 2,67 ug / ml Adenin, 40 n bestehtg / ml Hydrocortison, 10 ng / ml Cholera-Toxin, 4,94 & mgr; g / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin, 1,36 ng / ml Triiod-L-thyronin, 10 ng / ml EGF und 10 ug / ml Ciprofloxacin-Hydrochlorid. Filtern Sie die Medien durch ein 0,22 um-Filter und bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  3. Nehmen die Dermis aus dem 4x Pen / Strep + PBS-Lösung und wäscht 2 mal in KGM und dann in KGM bei 37 ° C für zwei Tage vor der Verwendung.
  4. Schneiden Sie die Lederhaut mit einem Skalpell bis 1,5 cm x 1,5 cm große Stücke schneiden und dann auf den organotypischen Kassette zu platzieren. Platzieren der Dermis mit der Oberseite der Dermis nach oben zeigt. Der obere Teil der Dermis wird die Seite, die in Kontakt mit den Keratinozyten (1B) kommt.
  5. Legen Sie die vorgeschnittenen Lederhaut auf die quadratische Öffnung des organotypischen Kassette mit der Oberseite der Dermis nach oben (3A).
  6. Klappen Sie den gesamten organotypischen Kassette, die die Lederhaut mehr als mit einer Pinzette (3B). Tauen die extrazelluläre Matrix-Lösung auf Eis. Verwenden Sie eine Nadel und Spritze zu ziehen 100 ul der extrazellulären Matrix-Lösung pro Kassette. 5 Tropfen auf den Boden der Dermis (glänzende Seite) und schütteln Sie leicht, um eine gleichmäßige Verteilung in der gesamten Dermis (3B) zu gewährleisten.
  7. Lassen Sie 5 Minuten für die kommerzielle extrazellulären Matrix-Lösung vollständig zu verfestigen (3C). Nach dem Erstarren verwenden Pinzette, um die Kassette wieder umdrehen. 4 ml KGM an die 6 cm Schale.
  8. Platzieren ,5-1.000.000 gentechnisch veränderten Keratinozyten auf die organotypische Kassetten, die die Lederhaut (Figur 3D).
    1. Trypsinize Keratinozyten, indem 4 ml von 0,05% Trypsin auf 10 cm-Platten für 5 min und schrecke mit 4 ml vollständigem DMEM-Medium.
    2. Zählen Sie die Keratinozyten mit einer Zählkammer und dann drehen bei 200 xg für 5 min nach unten. Resuspendieren 0.5-1 Millionen Zellen (in Abhängigkeit von der Anzahl der verfügbaren Zellen) in 90 μl KGM und legen Sie alle Zellen auf der Dermis.
      Hinweis: Es ist wichtig, dieselbe Anzahl von Zellen auf die Lederhaut in dem gleichen Experiment zu platzieren, um sicherzustellen, daß die Unterschiede in der Dicke der regenerierten Epidermis gesehen nicht aufgrund von Unterschieden im Ausgangszellzahl. Platzieren von weniger als 0,5 Millionen Zellen auf Dermis kann zu schlechter Schichtung und Differenzierung führen.
  9. Ändern KGM Medien auf die organotypische Kulturen jeden zweiten Tag. Erntegewebe 1-14 Tage nach der Platzierung der Keratinozyten auf der Dermis. Voll Schichtung und Differenzierung der Epidermis tritt in der Regel nach Tag 5.

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Ergebnisse

Der erste Schritt bei der Erzeugung von organotypischen menschliche Haut, um die Epidermis von der Dermis zu entfernen. Der zweiwöchigen Inkubation der Haut bei 37 ° C in 4 x Pen / Strep / PBS sollte die Trennung der Dermis von der Epidermis (1A) zu erlauben. Wenn die Trennung der Epidermis und Dermis ist schwierig, dann das Gewebe bei 37 ° C in 4x Pen / Strep / PBS für eine Woche und dann noch einmal versuchen Peeling mit einer Pinzette.

Einer der Schlüssel zum Regener...

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Diskussion

Genmanipulation in der menschlichen Haut organotypischen Kulturen bieten viele Vorteile häufig gelernten 2D kultivierten Zellen als auch Mausmodellen. 2D Kulturen fehlen die drei Zell-Zell und Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen dimensional in intakten Geweben und Organen gefunden. Jüngste Studien haben auch festgestellt, enorme Unterschiede zwischen 2D- und 3D-kultivierten Hautkrebszellen mit den 3D-kultivierten Zellen, die viel mehr Genexpression Ähnlichkeiten mit primären humanen Tumoren der Haut 16.<...

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Offenlegungen

We have nothing to disclose.

Danksagungen

Diese Arbeit war supportedby der American Cancer Society Forschung Gelehrte Grant (RSG-12-148-01-DDC) und dem CIRM Grund Biologie Award (RB4-05779).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Human skinNew York Firefighters Skin Bankhttp://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREPGIBCO15140-122
amphotropic phoenix cell linesATCCCRL-3213
FUGENE 6 transfection reagentPromegaE2691
Keratinocyte Media (KCSFM)Life Technologies17005042
DMEMGIBCO11995
Ham's F12Cambrex12-615F
FBSGIBCO10437-028
AdenineSigmaA-9795
Cholera ToxinSigma C-8052
HydrocortisoneCalbiochem3896
InsulinSigmaI-1882
EGFInvitrogen13247-051
Transferrin SigmaT-0665
Ciprofloxacin HydrochlorideSerologicals89-001-1
cauteryBovie Medical CorporationAA01
MatrigelCorning354234
Keratin 1 antibodyBiolegendPRB-149P
square pegsArts and crafts stores
human neonatal keratinocytesATCCPCS-200-010
human neonatal keratinocytesCell Applications102K-05n
MSCV retroviral vectorClontech634401
LZRS retroviral vectorAddgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vectorOligoengineVEC-PRT-0002 
hexadimethrine bromide SigmaH9268-5G

Referenzen

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