高效的哺乳动物细胞表达和细胞外糖蛋白的结晶一步纯化

摘要

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

摘要

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

引言

了解蛋白质结构在原子级别是关键揭露生物学途径和疾病的分子基础。 X射线蛋白质晶体是用于确定大分子结构最广泛使用的/适用的方法。该方法的主要挑战是获得足够数量的正确折叠的，纯的蛋白质。这变得尤其分泌哺乳动物蛋白质，其经历特定的翻译后修饰工作时的一个问题。

细菌表达的蛋白质是沉积在蛋白质数据银行¹中结晶蛋白质的主要来源。细菌表达系统在很大程度上是优选的，因为它们是快速，廉价和通常产生蛋白质的产量高。然而，哺乳动物蛋白的胞外域在细菌中表达通常不正确折叠的，在所要求的情况下的重折叠和大量的纯化步骤以获得均匀FOLDED蛋白质。此外，许多哺乳动物蛋白质需要的翻译后糖基化，以达到适当的折叠^2。虽然在酵母或昆虫细胞中表达和糖基化可以克服的折叠问题，翻译后修饰，包括糖基化，显著从那些哺乳动物细胞^3的不同，产生具有不正确的或不均质的修饰蛋白质。

哺乳动物细胞表达的所有必需的分子机制，以确保适当的翻译后修饰和折叠;然而，这些表达系统通常不优选由大多数实验室，由于有限的产率和试剂和消耗品成本高。聚乙烯亚胺（PEI），一个标准的转染试剂是相对便宜的，但施加相当的细胞毒性和低转染效率，从而导致在细胞培养基，脱氧核糖核酸成本增加，并培养设备。许多替代PEI是贵得离谱。我们解决这些问题通过描述和化学修饰的PEI的快速和相对便宜的方法为分泌的哺乳动物蛋白质的表达，随后单步纯化的改进的细胞培养工具的组合。这种强大的方法给出了足够的产率的功能和生化研究^4中，在某些情况下，导致蛋白质适合于结晶，无需进一步纯化。

本协议描述的几种技术，以最大限度地表达和产生于人类胚胎肾（HEK）分泌的哺乳动物蛋白悬浮培养细胞293F。转染效率（成本），蛋白生产和纯化都极大地按照该协议增强。 PEI通过单步开环反应中加入氨基甲酸酯改性（PEI-TMC-25，合成和性质的详细在文献^5中所述 ）大大提高转染效率，从阳离子减少的细胞毒性膜破坏，并相应地降低实验成本。此外，细胞存活率和蛋白质表达大大用加入了培养补充供应葡萄糖和维生素改善。重要的是，用于生产糖基化蛋白，治疗kifunensine的，甘露糖苷酶I的无毒的化学抑制剂，产生的蛋白质与定义，未成熟的聚糖，其可以通过该糖苷内切酶EndoHf被除去，得到的蛋白质与单个N-乙酰葡糖胺代替全长N-连接多糖^6。最后，蛋白质分泌到无血清，化学定义的培养基允许快速和简便的纯化用于结构和生化研究。单步镍 - 次氮基三乙酸（的Ni-NTA）树脂纯化去除大多数在上清液污染物种类和，在某些情况下，可以产生足够的纯度为蛋白质结晶。

研究方案

1.生产质粒DNA的毫克量为大规模瞬时转染的

1. 克隆感兴趣的蛋白质成使用限制性位点克隆，或其它适当的技术高的拷贝数的哺乳动物表达载体中。
   1. 为获得最佳的结果，使用pHLsec ⁷矢量，其中有一个内置的C末端的6His标签，强启动子Kozak序列和优化的分泌信号。
2. 变换质粒到感受态细胞。
   1. 添加20微升感受态大肠杆菌细胞的到1微克质粒DNA和在冰上孵育30分钟。
   2. 热休克的细胞在42℃下35秒，然后在冰上孵育2分钟。
   3. 添加300μl的微生物生长培养基（SOC），并在37℃下进行45分钟，摇动以220rpm。
   4. 板细胞在琼脂平板上适当的抗生素选择。
      1. 使用100微克/毫升羧苄青霉素，如果所述质粒是在pHLsec矢量。
3. 在250ml的Luria肉汤（LB）媒体的培养菌落补充有100微克/毫升抗生素（羧苄青霉素）O / N在37℃下，振荡以220rpm。
4. 净化从根据制造商的方案使用高速质粒Maxi试剂盒培养物DNA。
   1. 洗脱，代替缓冲器的TE缓冲液中的EB（10mM的三Cl，pH值8.5）的DNA。
   2. 分装纯化的质粒在在-20℃所需的转染和存储量。

的293F细胞2.大型文化和瞬时转染

1. 补充的1L 293F媒体用10ml谷氨酰胺和5ml青霉素/链霉素（均100倍）。保存在4℃。 5 ml的青霉素/链霉素是一个足够的强度在无血清条件下转染和在减压抗生素浓度提高细胞生存力，从而提高蛋白质的产量。
2. 文化293F细胞在300毫升的媒体在1升的聚碳酸酯挡板锥形瓶中通气帽s的37℃，8％CO _2中，一边摇动在标准组织培养箱中。
3. 稀释细胞之一转染前一天^5×10 5 / ml的密度。
4. 转染，补充培养基中加入的2％10％体积w / v的在293F媒体电池升压的一天。
   1. 使用根据制造商的说明和使用补充剂根据需要以达到500毫克/分升的葡萄糖浓度的血糖监测仪测量葡萄糖浓度。
5. 加kifunensine（1微克/毫升的最终浓度）在此步骤中，以控制蛋白质的糖基化。
6. 的DNA的计算量所需的每^1×10 6个细胞1微克质粒。在无菌条件下，稀释在5ml无血清培养基中的DNA。
7. 计算所需的每2 1微克质粒微升转染试剂转染试剂的体积。在无菌条件下，稀转染试剂（PEI-TMC-25）在5ml无血清培养基。
8. 加转染试剂成在1ml的增量DNA溶液，轻轻混合。温育30分钟，在RT下试剂-DNA复合物的形成。然后将溶液添加到细胞中逐滴的方式。
9. 允许转染的细胞表达蛋白72-96小时。补充用〜10％的体积电池升压日常必要的媒体，或保持血糖读数400〜600毫克/分升。

3.净化

1. 滗培养到离心瓶中，离心20分钟，1300×g离心以沉淀细胞，然后回收上清。如果需要的话，旋转的第二时间和/或使用0.22μm的过滤器，以澄清上清液。
2. 加10％的体积的10倍的Ni-NTA结合缓冲液（1.5M氯化钠，0.5 MK _{2 HPO 4，0.1M}的Tris pH值8.5，50mM咪唑）。
3. 通过加入2ml的Ni-NTA浆在一个柱并用1X结合缓冲液10倍柱体积（CV）的平衡准备一个重力柱。如果可能的话，请在4℃的房间内的所有列的步骤。可选择性伊利，寒意蛋白和列步骤之前，冰所有的缓冲区，并保持蛋白质和收集流过冰。
   注意:的Ni-NTA浆料是50％的树脂体积和制造商的说明结合容量为50毫克/毫升。的Ni-NTA珠可以被重新充电用于多种用途的
4. 流上清液过树脂，并收集流过。重复此步骤。
5. 用10CV的洗涤缓冲液洗涤（300毫摩尔NaCl，50 mM的_K 2 HPO _4，20mM咪唑的pH 8）中。
6. 洗脱蛋白在5 CV的洗脱缓冲液（300mM NaCl的50 mM的_K 2 HPO _4，250mM咪唑pH 8）中。
7. 如果去糖基化是必需的:
   1. 为0.5 ml的终体积，洗脱液浓缩，用离心浓缩器0.43毫升如果沉淀的形式，通过离心沉淀的任何碎屑在16000×g离心和4℃。
   2. 加入50微升500毫米柠檬酸钠pH值5.5。
   3. 加入20微升EndoHf（1×10 ⁶单位/毫升）中。在室温下孵育2小时。
      不E:酶工作最佳，在37℃，这可能会导致浓缩的蛋白质聚集，延长对RT温育后，如果去糖基化，通过SDS-PAGE或免疫印迹评估，是不完整的。酶不具有在4℃下的活性。
   4. 以除去EndoHf:洗净直链淀粉树脂3倍在磷酸盐缓冲盐水（PBS）或最终贮存缓冲液。孵育蛋白质与树脂1小时，在4℃。自旋5分钟，在1000×g离心沉淀珠粒并回收上清。
   5. 使用适当的分子量截留离心过滤器浓缩蛋白质和缓冲液交换成存储缓冲液（150毫摩尔NaCl和20mM HEPES pH7.5）中。

结果

本文如下施加到分泌13 kDa的免疫球蛋白（Ig）的结构域，从表达的髓样细胞上2（hTREM2，残基19-132）的人蛋白质触发受体该表达系统的结果。 TREM2是包含具有两个二硫键和两个N-连接糖基化位点的胞外单个Ig结构域I型跨膜蛋白。不像许多其他的Ig结构域蛋白^8，TREM2是不适合细菌包涵体⁹复性。随后的诱变证实N联聚糖都需要适当的表达和折叠。以促进结构和功能研究，TREM2引入pHLsec矢量?...

讨论

HEK 293F细胞提供强大的生产需要翻译后修饰的蛋白质。该系统允许含有二硫化物，糖基化，和磷酸化，否则将使用更常规的表达的工具不存在本机折叠的蛋白质的快速且可伸缩的表达。此外，该系统可用于表达和多蛋白复合物的纯化只需通过共转染多种质粒的构建。此外TREM2，该系统已经被广泛地用于与感兴趣在实验室^-10,11-其它蛋白质功能研究。哺乳动物细胞还提供用于体内实验?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use in place of Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cell Culture Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring System
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium for DNA transfection
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919