Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation

Résumé

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Résumé

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

Introduction

Comprendre la structure des protéines à un niveau atomique est clé pour découvrir la base moléculaire des voies biologiques et de maladies. X-ray cristallographie des protéines est la méthode la plus largement utilisée / applicable pour la détermination des structures macromoléculaires. Le principal défi de cette méthode est d'obtenir des quantités suffisantes de bien plié, protéine pure. Cela devient un problème particulier lorsque l'on travaille avec des protéines sécrétées mammifères, qui subissent des modifications post-traductionnelles spécifiques.

Protéines bactérienne exprimées sont la principale source de protéines cristallisées déposés dans la Protein Data Bank ^1. Des systèmes d'expression bactériens sont largement préférés parce qu'ils sont rapides, peu coûteux et généralement produire des rendements élevés de protéine. Cependant, domaines extracellulaires des protéines de mammifère exprimées dans des bactéries sont souvent pas correctement repliés, dans ce cas, repliement et purification extensive étapes sont nécessaires pour obtenir de façon homogène foLDED protéines. En outre, de nombreuses protéines de mammifères exigent glycosylation post-traductionnelle pour atteindre un repliement approprié ^2. Bien que l'expression et la glycosylation dans les cellules de levure ou d'insectes peuvent surmonter le problème de pliage, modifications post-traductionnelles, y compris la glycosylation, diffèrent considérablement de celles des cellules de mammifères ^3, produisant des protéines avec des modifications incorrectes ou non-homogènes.

Les cellules de mammifères expriment toute la machinerie moléculaire nécessaire pour assurer modifications et pliage de post-traductionnelle appropriés; Toutefois, ces systèmes d'expression ne sont pas généralement préféré par la plupart des laboratoires, en raison de rendements limités et des coûts élevés de réactifs et de consommables. Polyéthylèneimine (PEI), un réactif de transfection norme est relativement pas cher mais impose cytotoxicité considérable et une faible efficacité de transfection, résultant en une augmentation des coûts dans les médias de la cellule, l'ADN, et de l'équipement en culture. Beaucoup de solutions de rechange aux PEI sont prohibitifs. Nous nous adressonsces questions en décrivant une combinaison de l'amélioration des outils de culture cellulaire et chimiquement modifiée PEI pour la méthode rapide et relativement peu coûteux pour l'expression de protéines de mammifères sécrétées, suivie d'une purification en une seule étape. Ce procédé donne des rendements suffisants robuste pour des études fonctionnelles et biochimiques ^4, et dans certains cas, se traduit par une protéine se prêtent à une cristallisation sans autre purification.

Ce protocole décrit plusieurs techniques pour maximiser l'expression et le rendement pour les protéines de mammifères sécrété dans le rein embryonnaire humain (HEK) 293F cellules cultivées en suspension. L'efficacité de transfection (et le coût), la production et la purification de la protéine sont grandement améliorées tout en suivant le protocole. PEI modifié par l'addition de carbamates par réaction d'ouverture de cycle en une seule étape (PEI-TMC-25, synthèse et les propriétés décrites en détail dans la référence ⁵⁾ améliore grandement l'efficacité de transfection, réduit la cytotoxicité de cationiquerupture de la membrane et par conséquent de réduire les coûts d'expérimentation. En outre, la viabilité des cellules et l'expression des protéines sont grandement améliorées grâce à l'ajout de compléments de culture à fournir du glucose et des vitamines. Il est important pour la production de protéines glycosylées, le traitement par la kifunensine, un inhibiteur chimique non-toxique de la mannosidase I, produit des protéines avec définis glycanes immatures, qui peuvent être éliminés par la EndoHf d'endoglycosidase pour produire des protéines avec un seul N-acétylglucosamine à la place du une pleine longueur glycane ⁶ N-liée. Enfin, la sécrétion de protéines dans un milieu défini chimiquement sans sérum permet une purification rapide et facile pour les études structurales et biochimiques. Single-step nickel-acide nitrilotriacétique de (Ni-NTA) purification de résine élimine la majorité des espèces contaminantes dans le surnageant et, dans certains cas, peut donner une protéine d'une pureté suffisante pour la cristallisation.

Protocole

1. production de quantités milligramme d'ADN plasmidique à grande échelle pour la transfection transitoire

1. Cloner la protéine d'intérêt dans un certain nombre vecteur d'expression mammifère élevé de copies en utilisant le site de restriction clonage, ou une autre technique appropriée.
   1. Pour des résultats optimaux, utilisez pHLsec ⁷ vecteur, qui a un haut-C-terminal 6His-tag, une séquence forte Kozak promoteur et un signal de sécrétion optimisé.
2. Transformer le plasmide sur des cellules compétentes.
   1. Ajouter 20 ul de cellules compétentes de E. coli sur 1 ug d'ADN de plasmide et incuber sur de la glace pendant 30 min.
   2. Des cellules de choc thermique à 42 ° C pendant 35 sec, puis incuber sur de la glace pendant 2 min.
   3. Ajouter 300 pi de milieu de croissance microbienne (SOC) et incuber à 37 ° C pendant 45 minutes, en agitant à 220 rpm.
   4. Les cellules de plaque sur plaque de gélose avec la sélection antibiotique approprié.
      1. Utilisez 100 pg / ml de carbénicilline si le plasmide est dans le vecteur pHLsec.
3. Les colonies de la culture dans 250 ml de bouillon de Luria (LB) additionné de médias 100 ug / antibiotique (carbénicilline) O / N ml à 37 ° C, sous agitation à 220 tours par minute.
4. On purifie l'ADN à partir de la culture en utilisant un kit Salut débit Plasmid Maxi selon le protocole du fabricant.
   1. Eluer ADN dans un tampon EB (10 mM de Tris-Cl, pH 8,5), au lieu de tampon TE.
   2. Aliquoter le plasmide purifié au montant nécessaire pour la transfection et conserver à -20 ° C.

2. grande échelle Culture et transfection transitoire de cellules 293F

1. Supplément médias 1 L 293F avec 10 ml de glutamine et 5 ml Pen / Strep (deux 100x). Conserver à 4 ° C. 5 ml Pen / Strep est une résistance suffisante dans des conditions sans sérum et la concentration en antibiotique réduite améliore la viabilité des cellules au cours de la transfection, ce qui améliore les rendements en protéines.
2. Culture cellules 293F dans 300 ml médias dans 1 L polycarbonate déconcertés flacons Erlenmeyer avec bouchon à évents à 37 ° C avec _8% de CO2, sous agitation dans un incubateur de culture de tissu standard.
3. Diluer les cellules à 5 x 10 ⁵ / ml densité une veille de la transfection.
4. Le jour de la transfection, le milieu de culture par addition de supplément de volume de 10% à 2% en poids / volume dans 293F cellulaire Boost médias.
   1. Mesurer la concentration de glucose en utilisant un moniteur de glucose selon les instructions du fabricant et les suppléments d'utilisation selon les besoins pour obtenir une concentration en glucose de 500 mg / dL.
5. Ajouter kifunensine (1 pg / ml de concentration finale) à cette étape pour contrôler la glycosylation des protéines.
6. Calculer le volume de l'ADN requis pour une pg de plasmide pour 1 x 10 ⁶ cellules. Dans des conditions stériles, diluer l'ADN dans un milieu exempt de sérum de 5 ml.
7. Calculer le volume de réactif de transfection requis pour une pg de plasmide par 2 ul de réactif de transfection. Dans des conditions stériles, diluer le réactif de transfection (PEI-TMC-25) dans du milieu exempt de sérum de 5 ml.
8. Ajouterréactif de transfection d'ADN en solution dans 1 ml incréments, en mélangeant doucement. Incuber pendant 30 min à température ambiante pour les complexes ADN-réactif de se former. Puis ajouter la solution sur les cellules dans un mode goutte à goutte.
9. Laisser les cellules transfectées pour exprimer la protéine de 72-96 h. Supplément avec ~ 10% du volume cellulaire Boost médias quotidiens, ou au besoin pour maintenir le glucose lecture 400-600 mg / dl.

3. Purification

1. Décanter la culture dans un flacon de centrifugeuse, centrifugeuse pendant 20 min à 1300 x g pour sédimenter les cellules, puis recueillir le surnageant. Si nécessaire, faites tourner une deuxième fois et / ou utiliser le filtre de 0,22 um pour clarifier surnageant.
2. Ajouter tampon de liaison de 10% du volume 10x Ni-NTA (1,5 M de NaCl, 0,5 MK _{2 HPO 4,} Tris 0,1 M pH 8,5 mM imidazole 50).
3. Préparer une colonne de gravité par addition de 2 ml de suspension épaisse de Ni-NTA dans une colonne d'équilibrage et avec 10 volumes de colonne (CV) de tampon de liaison 1x. Si possible, faire toutes les étapes de colonne dans une chambre de 4 C °. AlternativEly, la protéine de refroidissement et tous les tampons sur la glace avant l'étape de la colonne, et garder la protéine et recueilli accréditives sur la glace.
   Remarque: Ni-NTA suspension est une résine de 50% en volume et de capacité de liaison déclaré de la fabrication est de 50 mg / ml. Ni-NTA beads peuvent être rechargées pour des usages multiples
4. Écouler le surnageant sur la résine et de recueillir accréditives. Répétez cette étape.
5. Laver avec 10 CV de tampon de lavage (300 mM de NaCl, 50 mM de K ₂ HPO _4, 20 mM d'imidazole pH 8).
6. Eluer la protéine en 5 CV de tampon d'élution (300 mM NaCl, 50 mM de K ₂ HPO _4, imidazole 250 mM, pH 8).
7. Si déglycosylation est nécessaire:
   1. Pour un volume final de 0,5 ml, on concentre l'éluat à 0,43 ml en utilisant un concentrateur de centrifugation. Si des précipités se forment, sédimenter les débris par centrifugation à 16.000 xg et 4 ° C.
   2. Ajouter 50 pi de 500 mM Na-Citrate pH 5,5.
   3. Ajouter 20 ul de EndoHf (1 x 10 ⁶ U / ml). Incuber à température ambiante pendant 2 h.
      ne pase: L'enzyme fonctionne de manière optimale à 37 ° C, ce qui peut provoquer le concentré de protéine agrégée. Prolonger l'incubation RT, si déglycosylation, évaluée par SDS-PAGE ou immunoblotting, est incomplète. L'enzyme n'a pas d'activité à 4 ° C.
   4. Pour supprimer EndoHf: Laver amylose Résine 3x dans un tampon phosphate salin (PBS) ou un tampon de stockage final. Incuber protéines avec de la résine pendant 1 h à 4 ° C. Spin 5 min à 1000 x g pour sédimenter perles et de recueillir le surnageant.
   5. Concentrez-protéine en utilisant un filtre approprié de centrifugation poids de coupure moléculaire et échange de tampon dans le tampon de stockage (NaCl 150 mM et HEPES 20 mM pH 7,5).

Résultats

Ici suit les résultats de ce système d'expression appliquée à une immunoglobuline sécrétée 13 kDa (Ig) le domaine de récepteur de protéine humaine exprimée de déclenchement sur les cellules myéloïdes (2, résidus 19-132 hTREM2). TREM2 est une protéine transmembranaire de type I contenant un seul domaine de type Ig extracellulaire qui dispose de deux ponts disulfure et deux sites de glycosylation N-liés. Contrairement à de nombreux autres domaines Ig protéines ^8, TREM2 ne se prêtaient pas...

Discussion

Cellules HEK 293F offrent une forte production de protéines nécessitant modifications post-traductionnelles. Ce système permet l'expression rapide et évolutive des protéines pliées contenant nativement disulfures, la glycosylation, la phosphorylation et qui, autrement, être absent en utilisant plus d'outils d'expression de routine. En outre, ce système peut être utilisé pour l'expression et la purification de complexes multi-protéines simplement par co-transfection de plusieurs plasmides. Outr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use in place of Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cell Culture Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring System
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium for DNA transfection
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919