的发展<em&gt;体外</em&gt;眼平台，试验用隐形眼镜

摘要

目前在体外模型来评估隐形眼镜（CLS）等眼睛相关的应用非常有限。所呈现的眼平台模拟生理泪液流，泪液量，空气暴露和机械磨损。这个系统是高度通用，并且可以被应用于各种体外根据CLS分析。

摘要

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,^1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.⁷ The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

引言

的接触透镜（CL）的竞技场内的感兴趣的两个显著领域包括不适和新颖CL应用的开发。阐明底层CL不适机制是已经躲避领域几十年来一个问题^。8新颖的发展，功能通函，如药物-递送装置^1,3,9和生物传感器^，10-12是越来越大的兴趣的区域，具有巨大潜力的市场。在这两种情况下， 体外模型精密将提供相关信息，以帮助在开发阶段选择合适的镜片材料或设计特征。不幸的是， 在体外模型用于评估CLS和其他眼部相关的应用目前都比较粗糙，不健全的。传统上， 在体外 CL研究评价泪膜沉积或药物输送含有固定的流体体积，静态的，大容量的小瓶中进行哪些格雷亚TLY超过生理量。此外，这种简单的模型缺乏天然泪液流分量和闪烁的反射，这两者都限定眼部环境的因素。

一个复杂的，生理相关的眼"模式"的发展将需要多学科的方法，并要求在体内验证可观。由于这些原因，对于我们的体外眼睛模型的基本框架是高度通用的，这样，该模型可以通过未来的升级和调制来不断改进。迄今为止，该模型能够模拟泪液量，撕裂流，机械磨损和空气暴露的。这样做的目的是创造一个体外模型，将提供有意义的结果，这是预测和免费在体内和离体观察。

研究方案

所有实验均按照和遵守滑铁卢大学的动物实验伦理委员会列出所有相关指引完成。牛眼睛都慷慨地从本地屠宰场捐赠的。

1.眼模型

1. 模具设计¹³生产
   1. 根据成人眼睛的生理平均尺寸设计眼球的机型^。13
   2. 离开的眼球和眼模型的眼睑片之间250微米的差距。设计采用计算机辅助设计（CAD）软件各自的模具。
   3. 创建新.cad文件或文件.SLDPRT与AutoCAD或Solidworks的。创建人的眼球/眼睑的3D模型。创建模型的模具和模具保存为.STL文件。
   4. 导入·STL文件到三维打印机的软件（ 例如，用于makeware replicator2）。指定打印参数（位置，稀疏，规模，方向，平滑度等 。 EM>）13。
   5. 将文件保存为G代码文件的3D打印机阅读。选择的材料，如聚乳酸（聚乳酸），ABS（丙烯腈-丁二烯-苯乙烯），PC（聚碳酸酯），或它们的组合，以打印模具^13。
   6. 安装所选择的材料的期望的长丝。导入G代码文件到三维打印机读取。打印模具。
      注:另外，生产用的控制（CNC）机计算机数字眼模，如果对眼睛模型光滑的表面是需要的。对于数控模具生产，对于模具材料不再局限于热塑料，而是扩大到金属，陶瓷和化学电阻聚合物如聚四氟乙烯。
   7. 打开连接到切割钻头CNC软件接口。根据前面，顶部，侧面，以及在控制软件接口的先前构造的眼球/眼睑模型模具的透视图构建的3D模具。选择合适的参数加工（比特大小，基片材料，材料的厚度），并继续切割模具。
2. 目镜使用PDMS的合成
   1. 使用注射器，措施10毫升体积的PDMS（聚二甲基硅氧烷）基并将其填充到15-50毫升离心管中。添加10％w / v的由PDMS的总重量，弹性体溶液。用搅拌棒，混合解决方案很好。
   2. 倒入PDMS溶液进入眼球和眼睑模具。允许PDMS到在RT O / N定居（或至少12小时）以开始聚合反应，以允许气泡以溶解出聚合物。
      注:确保没有留下可能上升或扩大PDMS气泡。
   3. 接着，把模具成75℃（167°F）的烘箱中1小时，或150℃（302°F）下5分钟。对于较软的凝胶，让PDMS坐在RT至少48小时至完全聚合。
   4. 把样品中的几分钟的冷冻;这将缩小PDMS和简化除去从模具的样品。提取使用薄铲模具目镜。
   5. 为的溶液进入眼球和眼睑片之间的空间内的输送，用1/16"等于腿耦合管连接器连接一个1/16"×1/8"的聚四氟乙烯管，它在配管孔连接到眼睑片。
3. 用琼脂糖片眼球的合成
   注:眼球片可以使用其它聚合物，例如琼脂糖来合成。下面的过程也可以被修改，以从各种琼脂的类型，如PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）或SDA（沙氏葡萄糖琼脂）的产生眼件。
   1. 以产生2％（2克/ 100毫升）的凝胶，测量​​2克琼脂糖，用100ml超纯水混合。使溶液到沸腾（100℃），使得琼脂糖完全溶解。让该溶液冷却5分钟。
   2. 将溶液倒入眼球模具，并使溶液冷却30分钟在室温。用锅铲取出眼球件。存储眼球琼脂-20 ℃冰箱供以后使用。用于微生物学研究中，消毒通过高压灭菌和/或UV照射眼球模具。
4. 牛角膜对眼球PDMS掺入
   注 :此协议已被改编自巴力等^[14]
   1. 在层流罩下执行在无菌条件下的牛角膜的解剖和掺入。获得眼睛和解剖它们在同一天。
   2. 打开对在使用前10分钟的流罩并用70％的乙醇酒精消毒。确保所有的材料和仪器是无菌的通过高压灭菌器在273°F / 133℃45分钟，和位于从所述流罩入口不小于4英寸。
   3. 浸入牛眼在含有2分钟稀释的聚维酮碘溶液的烧杯中。冲洗在烧杯眼含磷酸盐缓冲盐水（PBS）芘^ h 7.4。使用镊子轻轻地放在眼睛上的玻璃培养皿，角膜正面向上。
   4. 通过用钝头剪刀切开巩膜附着点切断去除多余的肌肉和脂肪组织。处置多余的组织的成指定用于动物废物的无菌烧杯中。
   5. 采用微型剪刀，从眼睛取出结膜。包住眼用无菌纱布，保持从角膜缘的至少为1厘米的距离。
   6. 使用手术刀，从角膜缘区域大约2mm切开巩膜和表面，以避免潜在的脉络膜和玻璃体的渗透。请小心地用手术刀或夹层剪刀360°的切口不角膜从它的自然弯曲变形。
   7. 用细镊子，取出从眼睛角膜。使用镊子，小心地取出任何秉承葡萄膜组织，用PBS冲洗角膜。
   8. 储存于31ºC角膜与文化的无菌容器中介质（如培养基199）含有3％胎牛血清保持组织的水分和细胞滋养。
   9. 之前的实验，搁置在PDMS眼球切除角膜，及两片用专门夹式夹紧在一起。

2.闪烁平台

1. 设计生产眨眼睛平台
   注:闪烁平台是由三个功能部分:眼模型（在第1中所述），齿轮系统和电子系统。
   1. 采用CAD和3D打印，类似的眼模型（1.1节）中描述的设计和制造闪烁的平台。设计齿轮系统，使得它转换马达入目镜的横向和旋转运动的简单的转动^。15
   2. 利用小齿轮和齿轮机构，翻译步进电机的旋转运动转换成一个小齿轮，其连接到所述眼睑片的横向运动。
   3. 使用共轭齿轮系统中，来自步进电机扩增一个旋转运动转化为三个不同的眼球片三个（或更多）的旋转运动。
   4. 对齐两个齿轮系统，一个用于眼睑和一个用于眼球，使两者之间的距离是恒定的。组装该电子系统与微控制器，马达罩，和两个马达。
      注意:使用两个步进电机提供的旋转电机，其由齿轮系统转换成闪烁动作。
   5. 用由堆叠在微控制器的电动机罩的一个系统连接的两个步进电机。连接和配置的电子元件与开源软件产品的工作。
   6. 编程系统来控制电机参数，例如每分钟轮（RPM），正向轮数轮向后的数目，和转动式。
      注:请参阅补充"的Arduino代码文件"的说明。
   7. 从马下载系统软件nufacturers的网站。
   8. 安装软件并打开它。写的代码，以控制步进电机在所需的配置。该系统连接与源到电子系统供电，使电机以期望的方式由研究人员所限定移动。
      注:请参阅补充"的Arduino代码文件"。
2. 大会与微流体（人造泪液）
   1. 以合成的眼球和眼睑片和防滑他们到其相应的夹式的眼睛模型。连接该接合用注射器和位于与眼睑片（部分1.2.5）微流体泵的管路。测试运行平台，并检查是否有一致的运动。
   2. 总理管道和检查的人造泪液（ATS）源源不断。对于ATS配方曾报道¹⁶
   3. 手动移动眼模型部件一起在水平平面上，使得该眼球和眼盖子相接触。设置微流体泵到所需值的流速。设定生理流速1-1.5微升/分^。17
   4. 启动泵和致动器，开始实验。用于药物递送的实验中，将含有药物的接触透镜在眼球片。
   5. 允许流通的流体滴落到12孔板中。在所需的设定的时间间隔，使用普通的检测方法，如UV-Vis光谱或荧光量化分析物或药物的浓度^。1,4,18
   6. 对于研究隐形眼镜评估泪液成分沉积，放置隐形眼镜的"眼球"作品。收集流通液，其可以被丢弃。
   7. 在所需的时间间隔后，从眼球片隐形眼镜，并准备作进一步的分析透镜如共焦显微镜。

结果

从机械车间和从3-D打印获得的合成眼模具如图1所示，这些霉菌可以与各种聚合物，如PDMS和琼脂糖一起使用，以产生具有所需性质的目镜。与微流体注射器泵的眼睛模型平台的示意组件示于图2，平台经由眼球片进出眼睑片的运动的旋转，并通过横向空气曝光模拟机械磨损。泪液流体注入眼睑从在所需流速的微流体泵，并流过流体可以在一个12孔板?...

讨论

有一些需要特别注意的协议中的三个关键步骤:设计和生产模具（第1.1节），装配平台（部分2.2.1-2.2.3），并监测实验运行（部分2.2.4-2.2.7 ）。在设计和生产模具（第1.1节）的观点出发，眼球片应根据一个人的角膜的尺寸来设计。然而，它可以由眼球片可以创建完全符合商用接触透镜（CL）之前所需要的模具的多个原型。另外，当眼球和眼睑片相接触，以确保泪液整个眼睛模型顺畅地流动时，CL为存...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled)	Adafruit	50	Board
Stepper motor	Adafruit	324	Motor and Motor shield
Equal Leg Coupler 1.6mm 1/16"	VWR	CA11009-280	50 pcs of tube connector
Tubing PT/SIL 1/16"x1/8"	VWR	16211-316	Case of 50feet
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation
Agarose, Type 1-A, low EEO	Sigma-Aldrich	A0169-25G
PHD UltraTM	Harvard Apparatus	703006	MicroFluidic Pump
Bovine cornea	Cargill, Guelph/ON
Soldidworks	Dassault Systemes		Software
3-D printing	University of Waterloo - 3D Print Centre
Dissection tools	Fine Science Tools		General dissection tools
Medium 199	Sigma-Aldrich		Culture medium storage for cornea
Fetal bovine serum	Thermo Fisher		Add to culture medium, 3% total volume