Desarrollo de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Plataforma ocular para probar las lentes de contacto

Resumen

Los modelos actuales in vitro para la evaluación de las lentes de contacto (CLS) y otras aplicaciones relacionadas con el ojo son muy limitadas. La plataforma ocular presentado simula fisiológica flujo lagrimal, volumen de lágrimas, la exposición al aire y el desgaste mecánico. Este sistema es muy versátil y se puede aplicar a diversos análisis in vitro con CLS.

Resumen

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,^1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.⁷ The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Introducción

Dos importantes áreas de interés dentro de la arena de lentes de contacto (CL) incluyen malestar y el desarrollo de nuevas aplicaciones CL. Elucidar los mecanismos subyacentes CL malestar es un tema que ha eludido el campo durante décadas. ⁸ El desarrollo de la novela, CL funcionales, tales como dispositivos de liberación de fármacos ^1,3,9 y biosensores, ^10-12 es un área de creciente interés, con los mercados potenciales sustanciales. En ambas circunstancias, un sofisticado modelo in vitro podría proporcionar información relevante para ayudar en la selección de materiales de lentes o características de diseño apropiado durante la fase de desarrollo. Por desgracia, la corriente en modelos in vitro para la evaluación de las NFT y otras aplicaciones relacionadas con el ojo son relativamente crudo y poco sofisticado. Tradicionalmente, se llevan a cabo en los estudios in vitro que evalúan CL deposición de la película lagrimal o la administración de fármacos en viales de volumen estáticas, grandes que contienen un volumen de fluido fijo, que GREAtly excede cantidades fisiológicas. Además, este modelo simple no tiene la componente de flujo de lágrima natural y el reflejo del parpadeo, ambos de los cuales son la definición de factores del entorno ocular.

El desarrollo de un "modelo" sofisticado, fisiológicamente relevante ojo requerirá un enfoque multidisciplinar y requieren sustancial en la validación in vivo. Por estas razones, el marco fundamental para nuestro modelo de ojo in vitro es altamente versátil, de tal manera que el modelo puede ser mejorado continuamente a través de las actualizaciones futuras y modulaciones. Hasta la fecha, el modelo es capaz de simular el volumen de lágrimas, el flujo de lágrimas, desgaste mecánico y la exposición al aire. El objetivo es crear un modelo in vitro que proporcionará resultados significativos, que es predictivo y conexión a in vivo y ex vivo observaciones.

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Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo y cumpliendo con todas las directrices pertinentes señalados por la Universidad de Waterloo comité de ética de la investigación con animales. Los ojos bovinos son donados generosamente de un matadero local.

1. Modelo de ojos

1. Diseño y producción de moldes ¹³
   1. Diseño de los modelos de ojo de acuerdo con las dimensiones fisiológicas promedio de los ojos humanos adultos. ¹³
   2. Deje un espacio de 250 m entre el globo ocular y el párpado las piezas del modelo de ojo. Diseñar los moldes respectivos utilizando el software de diseño (CAD) asistido por ordenador.
   3. Crear nuevo archivo o archivo .cad .sldprt con AutoCAD o SolidWorks. Crear modelos 3D del globo ocular / párpado humano. Crear moldes de los modelos y guardar los moldes como archivos .stl.
   4. Importar archivos .stl en el software de la impresora 3D (por ejemplo, para makeware replicator2). Especificar parámetros de la impresión (ubicación, poca densidad, escala, orientación, suavidad, etc. ) ^13.
   5. Guarde el archivo como archivo de código G para las impresoras 3D para leer. Seleccionar materiales tales como PLA (ácido poliláctico), ABS (acrilonitrilo butadieno estireno), PC (policarbonato), o una combinación de los mismos, para imprimir los moldes ^13.
   6. Instalar filamento deseada del material de elección. Importe el archivo de código G en la impresora 3D para leer. Imprimir el molde.
      NOTA: Como alternativa, producir los moldes de los ojos utilizando un numérico por computadora (CNC) de la máquina controlada, si se desea una superficie más lisa en el modelo de ojo. Para la producción de moldes CNC, los materiales para moldes ya no se limitan a los plásticos térmicos, sino que se extienden a metal, cerámica, y polímeros químicamente resistentes tal como politetrafluoroetileno.
   7. Abra la interfaz de software CNC que está conectado a un taladro de corte. La construcción de moldes en 3D de acuerdo con la parte frontal, superior, lateral y vistas en perspectiva de los moldes modelo globo ocular / párpado construidos previamente en la interfaz del software de control. Seleccione los parámetros adecuados para lamecanizado (tamaño de la broca, material de sustrato, el espesor del material) y proceder a cortar el molde.
2. Síntesis de Oculares Uso de PDMS
   1. Usando una jeringa, mida 10 ml de volumen de PDMS base (polidimetilsiloxano) y llenarlo en un tubo de centrífuga de 15-50 ml. Añadir 10% w / v de la solución de elastómero en peso total de PDMS. Usando una varilla de agitación, mezclar bien las soluciones.
   2. Se vierte la solución de PDMS en los moldes del globo ocular y el párpado. Permitir que el PDMS se asienten a TA S / N (o por lo menos durante 12 horas) para iniciar la polimerización y para permitir que las burbujas se disuelven fuera del polímero.
      NOTA: Asegúrese de que no hay burbujas que quedan en el PDMS que podrían aumentar o ampliar.
   3. Posteriormente, colocar los moldes en un horno de 75 ° C (167 ° F) durante 1 hora, o 150 ° C (302 ° F) durante 5 min. Para un gel suave, permiten el PDMS se sientan a temperatura ambiente durante al menos 48 horas para polimerizar por completo.
   4. Poner las muestras en un congelador durante unos minutos; esto va a reducir el tamaño de PDMS y simplificarla eliminación de las muestras de los moldes. Extraer los oculares de los moldes utilizando una espátula fina.
   5. Para la entrega de la solución en el espacio entre el globo ocular y el párpado piezas, conectar un tubo de politetrafluoroetileno 1/16 "x 1/8" con un conector de tubo acoplador igual pierna 1/16 "y adjuntarlo a la pieza del párpado en el agujero de la tubería .
3. Síntesis del globo del ojo de pieza utilizando agarosa
   NOTA: La pieza globo ocular se puede sintetizar utilizando otros polímeros tales como agarosa. El siguiente procedimiento también puede ser modificado para producir piezas de ojo de una variedad de tipos de agar, tales como PDA (patata dextrosa agar) o SDA (Sabouraud dextrosa agar).
   1. Para producir un gel 2% (2 g / 100 ml), medida 2 g de agarosa y se mezcla con 100 ml de agua ultrapura. Se lleva la solución a ebullición (100 ºC) tal que la agarosa se disuelva completamente. Deje que la solución se enfríe durante 5 min.
   2. Verter la solución en el molde globo ocular y permita que la solución se enfríe durante 30 min a TA. Retire las piezas del globo ocular con una espátula. Almacenar el agar globo ocular en un -20 ° C congelador para su uso posterior. Para los estudios de microbiología, esterilizar los moldes globo del ojo por tratamiento en autoclave y / o UV-irradiación.
4. La incorporación de bovino Córnea en PDMS del globo del ojo
   NOTA:. Este protocolo ha sido adaptado de Parekh et al ¹⁴
   1. Realizar la disección y la incorporación de las córneas de bovino en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Adquirir los ojos y diseccionar ellos en el mismo día.
   2. Girar la campana de flujo por 10 min antes de su uso y desinfectar con alcohol etanol 70%. Asegúrese de que todos los materiales e instrumentos son estériles en autoclave a 273 ° F / 133 ° C durante 45 minutos, y se posicionan no menos de 4 pulgadas de la campana de flujo de entrada.
   3. Sumergir el ojo bovina en un vaso de precipitados que contiene una solución de povidona yodada diluida para 2 min. Enjuague el ojo en un vaso de precipitados que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4. Utilizando unas pinzas colocan suavemente el ojo en una placa de Petri de vidrio, la cara de la córnea hacia arriba.
   4. Eliminar el exceso de músculo y tejido graso por el corte en los puntos de fijación escleral con tijeras de disección extremo romo. Desechar el exceso de tejido en un vaso estéril designada por los residuos animales.
   5. El uso de micro-tijeras, retirar la conjuntiva del ojo. Envolver el ojo con una gasa estéril, manteniendo una distancia de al menos 1 cm desde el limbo.
   6. El uso de un escalpelo, incisión de la esclerótica de aproximadamente 2 mm de la región de limbo y superficialmente con el fin de evitar la penetración de la coroides subyacente y el cuerpo vítreo. Extienda cuidadosamente la incisión de 360 ​​° con un bisturí o unas tijeras de disección sin deformar la córnea de su curvatura natural.
   7. Con unas pinzas finas, eliminar la córnea del ojo. Con unas pinzas, retire con cuidado cualquier tejido uveal adherirse córnea y enjuague con PBS.
   8. Almacenar la córnea a 31ºC en un recipiente estéril con la culturamedio (tal como el medio 199) que contiene 3% de suero bovino fetal para mantener la humedad del tejido y la nutrición celular.
   9. Antes de la experimentación, descansar la córnea extirpada en el globo ocular PDMS, y la abrazadera de las dos piezas juntas con un clip especializada.

2. Blink-plataforma

1. Diseño y Producción de la Blink-plataforma
   NOTA: El parpadeo de la plataforma se compone de tres partes funcionales: modelo de ojo (descrito en el apartado 1), sistema de engranajes, y el sistema electrónico.
   1. Diseño y fabricación de la plataforma usando un abrir y cerrar de CAD y la impresión en 3D, de forma similar a la descrita en el modelo de ojo (sección 1.1). Diseñar el sistema de engranajes de tal manera que se traduce simple rotación de los motores en los movimientos laterales y de rotación de los oculares. ¹⁵
   2. Usando el piñón y el mecanismo de engranaje, traducir el movimiento de rotación de un motor paso a paso en el movimiento lateral de un piñón, que está conectado a las piezas de los párpados.
   3. Utilizando elsistema de engranaje conjugado, amplificar un movimiento de rotación de un motor paso a paso en tres (o más) movimientos de rotación de tres piezas diferentes del globo ocular.
   4. Alinear los dos sistemas de engranajes, uno para el párpado y uno para globo ocular, de modo que la distancia entre los dos son constantes. Montar el sistema electrónico con un microcontrolador, el blindaje del motor, y dos motores.
      NOTA: Utiliza dos motores paso a paso para proporcionar los motores de rotación, lo que se traduce por el sistema de engranajes en un movimiento intermitente.
   5. Conectar los dos motores paso a paso con un sistema que consiste en un protector del motor de apilado en el microcontrolador. Conectar y configurar los componentes electrónicos para trabajar con productos de software de código abierto.
   6. Programar el sistema para controlar los parámetros del motor tales como disparos por minuto (RPM), el número de rondas hacia adelante, hacia atrás número de rondas, y el estilo de girar.
      NOTA: Consulte el "archivo de código Arduino" suplementaria para los detalles.
   7. Descargar el software del sistema de la mafabrican- página web.
   8. Instalar el software y abrirlo. Escribir el código para el control de motores paso a paso en la configuración deseada. Conectar el sistema con una fuente para alimentar el sistema electrónico, de modo que los motores se mueven en la forma deseada tal como se define por el investigador.
      NOTA: Consulte el "archivo de código Arduino" complementario.
2. Asamblea con la microfluídica (solución de lágrimas artificiales)
   1. Tome el globo ocular sintetizado y piezas del párpado y el deslizamiento en sus correspondientes clip-ons para el ojo-modelo. Conectar el tubo que se une con una jeringa y se coloca en la bomba de microfluidos con la pieza de párpados (sección 1.2.5). Prueba de funcionamiento de la plataforma y comprobar si hay movimiento constante.
   2. El primer tubo y comprobar si hay un flujo constante de solución de lágrimas artificiales (ATS). La receta para el ATS se ha informado anteriormente. ¹⁶
   3. mover manualmente las partes del ojo-modelo juntos en un nivel plano, de manera que el globo ocular y el ojotapa están en contacto. Ajuste el caudal de la bomba de microfluidos a los valores deseados. Fijar las tasas de flujo fisiológico de 1-1,5 l / min. ¹⁷
   4. Arrancar la bomba y los actuadores para comenzar el experimento. Para los experimentos de liberación de fármacos, colocar la lente de contacto que contiene el fármaco en la pieza globo ocular.
   5. Deje que el flujo de fluido a través de goteo en una placa de 12 pocillos. En los intervalos de tiempo de ajuste deseado, cuantificar la concentración de analito o fármaco usando métodos de detección comunes, tales como espectroscopía de UV-Vis o fluorescencia. ^1,4,18
   6. Para los estudios que evalúan la deposición de componentes de la lágrima en lentes de contacto, coloque la lente de contacto en la pieza "a ojo". Recoger el fluido de flujo a través, que puede ser desechado.
   7. Después de los intervalos de tiempo deseados, retirar la lente de contacto de la pieza de globo ocular y preparar la lente para su posterior análisis como la microscopía confocal.

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Resultados

Los moldes ojo sintetizados obtenidos a partir de la tienda de la máquina y de la impresión 3-D se muestran en la Figura 1. Estos moldes se pueden utilizar con una variedad de polímeros, tales como PDMS y agarosa, para producir los oculares con las propiedades deseadas. El conjunto de señas de la plataforma de modelo de ojo con una bomba de jeringa de microfluidos se muestra en la Figura 2. La plataforma simula el desgaste mecánico a través de la r...

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Discusión

Hay tres pasos críticos dentro del protocolo que requieren una atención especial: diseño y producción de moldes (sección 1.1), conjunto de plataforma (sección 2.2.1-2.2.3), y el seguimiento de la ejecución experimental (sección 2.2.4-2.2.7 ). En términos del diseño y la producción de moldes (sección 1.1), la pieza de globo ocular debe ser diseñado de acuerdo con las dimensiones de una córnea humana. Sin embargo, se puede requerir múltiples prototipos del molde antes de una pieza globo ocular puede ser cre...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled)	Adafruit	50	Board
Stepper motor	Adafruit	324	Motor and Motor shield
Equal Leg Coupler 1.6mm 1/16"	VWR	CA11009-280	50 pcs of tube connector
Tubing PT/SIL 1/16"x1/8"	VWR	16211-316	Case of 50feet
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation
Agarose, Type 1-A, low EEO	Sigma-Aldrich	A0169-25G
PHD UltraTM	Harvard Apparatus	703006	MicroFluidic Pump
Bovine cornea	Cargill, Guelph/ON
Soldidworks	Dassault Systemes		Software
3-D printing	University of Waterloo - 3D Print Centre
Dissection tools	Fine Science Tools		General dissection tools
Medium 199	Sigma-Aldrich		Culture medium storage for cornea
Fetal bovine serum	Thermo Fisher		Add to culture medium, 3% total volume