使用IL-1β启动子驱动的红色荧光蛋白记者小鼠中性粒细胞引发的活体成像

摘要

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

摘要

中性粒细胞是人体血液循环中最丰富的白细胞，并迅速募集到炎症部位。底漆是增强中性粒细胞的吞噬功能的重要事件。虽然大量研究纷纷亮相感染和损伤过程中存在的和中性粒细胞引发的重要性，意味着可视化这一进程的体内已经不可用。所提供的协议使嗜中性粒细胞在活的动物引发的动态过程的监测通过组合三种方法:1）红色荧光蛋白报告信号-作为吸2） 在体内嗜中性粒细胞标记的量度-通过荧光标记的抗淋巴细胞抗原的注射来实现6G（Ly6G）单克隆抗体（mAb）和3）活体共焦成像。几个关键步骤都参与了这一协议:恶唑酮诱导小鼠耳部皮肤炎症，动物适当镇静，抗Ly6G单抗重复注射，和prev成像过程中的焦点漂移ention。虽然有一些限制已经观察到，如连续成像时间（〜8小时）在一只小鼠的限制和异硫氰酸荧光素 - 葡聚糖从血管中的炎症状态的泄漏，该协议提供用于活体成像的基本框架底漆嗜中性粒细胞的行为和功能，可以很容易地扩展到在小鼠炎症模型其他免疫细胞的检查。

引言

中性粒细胞在流通中最丰富的，短命的白细胞。他们迅速招募到感染或损伤部位，在那里他们通过与含有抗菌肽和蛋白酶¹粒沿着活性氧和氮中间体的发布作为专业的吞噬细胞。在他们的招聘，中性粒细胞"引"的各种试剂，包括微生物产物，趋化因子和炎症细胞因子，从而在抵达机场时明显增强吞噬细胞的功能在炎症²的网站。嗜中性粒细胞引发的机制已被广泛研究的体外 ^3,4;然而， 在体内的过程的动态监控一直不可能日期。

最近，活体成像已成为用于可视化和量化生物过程的细胞动力学在活生物体的重要技术。 IntraviTAL成像可通过常规的单光子激发显微术来进行（ 例如，共焦）或多光子显微镜接近^5。随着时间的推移，大量的改进已在该技术实现更高的图像分辨率，改善成像深度达到，组织光损伤和增强防抖^6,7下降。鉴于其独特的，以使随着时间的推移细胞迁移和互动的动态可视化能力，活体显微镜已广泛应用于免疫学⁸应用研究的不同领域。活体成像使免疫​​学家更好地理解和背景情况在活的动物模型在细胞和分子水平上既免疫应答。

在转基因的最新进展以及敲入报告小鼠已用于监测中性粒细胞的动力学行为活体动物提供了有用的工具。溶菌酶M助驱动的增强型绿色荧光蛋白敲入小鼠已被广泛使用在各种炎性过程，包括外渗，细菌感....

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研究方案

所有的动物实验都按照健康指导全国学院进行，由托莱多大学的机构动物护理和使用委员会批准。

1. pIL1-红色荧光蛋白的小鼠的表型

注:后代是通过育种杂pIL1-DsRed的小鼠与野生型（WT）C57BL6小鼠产生。三，四周龄的幼崽被认为是准备表型。小鼠颌下腺出血如下稍作修改²³既定的协议。

1. 从乳鼠的全血白细胞分离
   1. 加入20μl肝素的每个1.5 ml离心管。
   2. 获得从笼子1小狗。记录小狗的识别标签。它不需要从颌下静脉麻醉采血前幼仔。
   3. 颈部颈背举行的小狗和皮尔斯在次颌下静脉使用5mm柳叶刀ê颊囊。适当用力创建一个小的穿刺，让血滴从切入点散发。使用新的针头为每小狗。
   4. 收集3 - 每个小狗血5滴在含有肝素的离心管中。清洁穿刺部位和施加压力，以促进止血。
   5. 放小狗在新笼子和笼返回到动物设施之前观察30分钟。
   6. 从已知的表型作为阳性和阴性对照的成年小鼠收集血液。
   7. 加入500微升的红血细胞裂解缓冲液中向每个管中，涡流管，并孵育5 - 在冰上10分钟。
   8. 慢慢加入400 - 500微升的胎牛血清（FBS），在每个管中的细胞悬浮液的下方。一个明显的界面可以在上层的细胞悬浮液和FBS的下层之间被观察到。
   9. 帽....

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结果

pIL1-DsRed的小鼠的筛选是根据通过使用流式细胞仪的外周血白细胞产生的表型DsRed的荧光信号进行。 LPS刺激已知诱导IL-1β生产的骨髓细胞包括中性粒细胞，单核细胞和树突状细胞^26-28。因此，分离的白细胞培养用LPS用于向流式细胞仪分析前4小时。接着，门被设置在这个门控群体测量循环基于小区大小（FSC）和内部的复杂性（SSC）（ 图^1A）29，和.......

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讨论

本研究的目的是开发一种技术用于监测中性粒涂刷的过程在活的动物，这尚未得到满足由目前可用的技术。为了实现这一目标，三既定方法被执行:1）皮肤炎症的诱导IL-1β的启动子驱动的DsRed的报告小鼠作为涂刷的量度，用低剂量的荧光缀合的抗Ly6G的嗜中性粒细胞的2） 体内标记单克隆抗体，以及3）活体共聚焦显微镜成像。这三种方法的组合使炎性皮损致敏中性粒细胞（红色荧光蛋白⁺

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin sodium	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer	Lonza	10-548E
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F0926
Lipopolysaccharides	Sigma-Aldrich	L4391
Ketamine hydrochloride	Hospira	NDC 0409-2051-05
Xylazine	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
Acepromazine	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
Hair-removal cream	Church & Dwight
Acetone	Fisher Scientific	A16P4
Oxazolone	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody	BioLegend	127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa	Sigma-Aldrich	74817
Butterfly infusion set (27 G needle)	BD	387312
FACSCalibur cytometer	BD
CellQuest Pro software	BD
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Metamorph Software	Universal Imaging