Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage Utilisation de IL-1ß conduit promoteur-DsRed Souris Reporter

Résumé

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Résumé

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation sanguine humaine et sont rapidement recrutés pour des sites inflammatoires. Amorçage est un événement critique qui améliore la fonctionnalité phagocytaire des neutrophiles. Bien que des études approfondies ont dévoilé l'existence et l' importance de neutrophiles amorçage lors de l' infection et des blessures, des moyens de visualisation de ce processus in vivo ont été indisponibles. Le protocole fourni permet de surveiller le processus dynamique de neutrophiles amorçage chez les animaux vivant en combinant trois méthodes: 1) Signal rapporteur DsRed - utilisé comme une mesure d'amorçage 2) in vivo étiquetage des neutrophiles - réalisé par injection de l' antigène anti-lymphocyte fluorescence conjugué 6G (Ly6G) anticorps monoclonal (mAb) et 3) l'imagerie confocale intravitale. Plusieurs étapes critiques sont impliqués dans ce protocole: la souris inflammation induite par l'oxazolone-cutanée de l'oreille, la sédation appropriée des animaux, des injections répétées de mAb anti-Ly6G et prevention de la dérive de mise au point lors de l'imagerie. Bien que quelques limitations ont été observées, telles que la limite de temps d'imagerie continue (~ 8 h) chez une souris et la fuite de l'isothiocyanate de fluorescéine-dextran de vaisseaux sanguins dans l'état inflammatoire, ce protocole fournit un cadre fondamental pour l'imagerie intravitale de le comportement apprêté neutrophile et la fonction, qui peut être facilement étendu à l'examen d'autres cellules immunitaires dans les modèles d'inflammation de la souris.

Introduction

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants et de courte durée en circulation. Ils sont rapidement recrutés pour les sites d'infection ou d'une blessure, où ils servent phagocytes comme professionnels par la libération d'oxygène et d' azote intermédiaires réactifs ainsi que des granulés contenant des peptides et des protéases ¹ antimicrobiens. Au cours de leur recrutement, les neutrophiles sont "apprêtées" par divers agents , y compris les produits microbiens, chemoattractants et cytokines inflammatoires, entraînant nettement amélioré la fonctionnalité phagocytaire arrivée à un site d'inflammation ^2. Les mécanismes d'amorçage de neutrophiles ont été étudiés in vitro ^3,4; Toutefois, le suivi dynamique du processus in vivo n'a pas été possible à ce jour.

Récemment, l'imagerie intravitale est devenue une technique importante pour la visualisation et la quantification de la dynamique cellulaire des processus biologiques dans les organismes vivants. Intraviimagerie tal peut être réalisée par excitation au microscope un photon classique (par exemple, confocale) ou des approches microscopie multiphotonique ^5. Au fil du temps, des améliorations substantielles ont été réalisées dans cette technique permettant une meilleure résolution d'image, l' amélioration de la profondeur d'imagerie, une diminution de photovieillissement de tissu, et le renforcement de ^6,7 de stabilisation d'image. Compte tenu de sa capacité unique de permettre une visualisation dynamique de la migration cellulaire et l' interaction au fil du temps, la microscopie intravitale a été largement appliquée à divers domaines d'études en immunologie ^8. imagerie intravitale permet immunologistes de mieux comprendre et contextualiser les réponses immunitaires à la fois au niveau cellulaire et moléculaire dans la vie des modèles animaux.

Des progrès récents dans transgéniques ainsi que des souris knock-in rapporteuses ont fourni des outils utiles pour la surveillance des comportements dynamiques des neutrophiles chez les animaux vivants. Lysozyme M promoteur-driven améliorée protéine fluorescente verte knock-inles souris ont été largement utilisés pour caractériser la motilité des neutrophiles, des monocytes et des macrophages au cours de divers processus inflammatoires comprenant une extravasation, une infection bactérienne, une inflammation stérile et ^9-15. En outre, des souris transgéniques exprimant une résonance de fluorescence cytoplasmique de transfert d'énergie biocapteur ont été utilisés dans l' étude de l'activité des neutrophiles mitogene kinase extracellulaire régulée et la protéine kinase A l' intérieur de l' intestin enflammées ^16. Un modèle de souris avec une spécificité élevée pour l' expression de la fluorescence dans des neutrophiles est la souris knock-in Catchup, qui produit la recombinase Cre, ainsi que la tdTomato protéine fluorescente, qui est lui - même couplé à l' expression de l' antigène des lymphocytes 6G (Ly6G) ^17. Visualisation des neutrophiles Ly6G déficientes par ce modèle a montré que ces cellules exercent une fonctionnalité normale dans une variété de contextes in vivo inflammatoires stériles ou infectieuses. Des souris transgéniques exprimant la DsRed fluorescente protein gène sous le contrôle de la souris interleuikin-1β (IL-1β), le promoteur (pIL1-DsRed) ont été utilisés pour visualiser les comportements motiles de cellules produisant de l'IL-1 ß - censé inclure les neutrophiles, les monocytes inflammatoires et des macrophages activés - émergents dans la peau enflammée ^18.

In vivo l' étiquetage peut servir comme une approche alternative pour tracer les comportements cellulaires et moléculaires de neutrophiles dans les tissus enflammés. Après injection intraveineuse de faibles doses de fluorescence anticorps anti Gr-1-anticorps monoclonal (mAb), la cascade de recrutement de Gr-1 ⁺ neutrophiles a été visualisées dans des lésions de la peau de souris infectées par Staphylococcus aureus ^19. L' administration in vivo des conjugués contenant de la streptavidine conjugués 705 points quantiques nm et biotinylé anti-Ly6G mAb étiqueter spécifiquement neutrophiles circulants ^20. En outre, l'endocytose de ces conjugués dans neutrophvésicules IL permet le suivi du transport vésiculaire à grande vitesse dans les neutrophiles qui migrent dans le tissu interstitiel. In vivo , le marquage avec des anticorps fluorescents conjugués contre la P-sélectine glycoprotéine ligand-1 (PSGL-1), L-sélectine (CD62L), l' intégrine aM (CD11b ) et chimiokines (CXC motif) récepteur 2 (CXCR2) dans un modèle inflammatoire induite par le TNFa a élucidé les mécanismes de régulation en jeu lors de l' inflammation précoce ^21. polarisants neutrophiles font saillie uropodes PSGL-1-enrichi à interagir avec CD62L présent sur les plaquettes activées, ce qui entraîne une redistribution des CD11b et CXCR2, des récepteurs qui stimulent la migration des neutrophiles et déclenchent l'inflammation.

IL-1β est l' un des gènes de signature qui est élevée dans les ²² neutrophiles amorcées. Chez les souris rapporteurs pIL1-DsRed, des signaux de fluorescence DsRed (ie., L' activation du promoteur IL-1β) une corrélation positive avec l' IL-1β expression de l' ARNm et de la production de la protéine IL-1β. ^{18 Pour surveiller le processus de neutrophiles amorçage, une méthode de microscopie intravitale a été développé impliquant l' induction de l' inflammation de la peau avec oxazolone (OX) dans le modèle de la souris pIL1-DsRed après marquage in vivo des neutrophiles avec fluorescence conjugué anti-Ly6G mAb. À travers ce modèle, il est possible d'étudier le comportement et la fonction des neutrophiles amorcées dans des modèles animaux de diverses maladies et affections.}

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux sont effectuées en conformité avec les instituts nationaux de directives de santé et approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de Toledo.

1. phénotypage de pIL1-DsRed Souris

NOTE: Offspring sont générés par l'élevage des souris pIL1-DsRed hétérozygotes souris de type sauvage (WT) C57BL6. Trois à quatre semaines vieux chiots sont considérés comme prêts pour le phénotypage. Saignements Submandibulaire de souris suit un protocole établi avec des modifications mineures ^23.

1. Isolement des globules blancs du sang total de Pups souris
   1. Ajouter 20 ul d'héparine à chaque tube de 1,5 ml.
   2. Acquérir un chiot de la cage. Enregistrez l'étiquette d'identification du chiot. Il est pas nécessaire pour anesthésier les chiots avant le prélèvement de sang dans la veine sous-maxillaire.
   3. Tenez chiot par le cou scruff et percer la veine submandibulaire dans ee abajoue en utilisant un 5 mm lancette. Appliquer une force adéquate pour créer une petite perforation, de sorte que des gouttes de sang exsudent du point de pénétration. Utilisez une nouvelle aiguille pour chaque chiot.
   4. Collecter 3 - 5 gouttes de sang par chiot dans un tube à centrifuger contenant de l'héparine. Nettoyer le site de ponction et appliquer une pression pour faciliter l'hémostase.
   5. Mettez chiot dans une nouvelle cage et observer pendant 30 minutes avant de retourner la cage à l'animalerie.
   6. Recueillir le sang des souris adultes d'un phénotype connu en tant que témoins positifs et négatifs.
   7. Ajouter 500 pi de tampon de lyse des globules rouges dans chaque tube, les tubes à vortex et laisser incuber pendant 5 à 10 min sur la glace.
   8. ajouter lentement 400 - 500 ul de sérum de fœtus bovin (FBS), sous les suspensions de cellules dans chaque tube. Une interface claire peut être observée entre la suspension de cellules de couche supérieure et la couche inférieure de FBS.
   9. tubes Cap et des échantillons de centrifugation à 1500 × g pendant 5 min.
   10. Répétez les étapes 1.1.7 - 1.1.9 à la fourrureTher éliminer les globules rouges. Ne pas répéter si la lyse est suffisante pour la première fois. Le culot doit être difficile de discerner après centrifugation.
2. Lipopolysaccharide (LPS) Stimulation et Culture
   1. Resuspendre les cellules dans 200 pi de complète Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen.
   2. Transférer la suspension cellulaire à un tube de cytométrie en flux.
   3. Faire LPS solution de travail en mélangeant 10 pl de LPS solution mère (1 mg / ml) avec 990 ul de milieu RPMI 1640 complet.
   4. Ajouter 20 pi de 10 pg / ml de LPS solution de travail à 200 ul de suspension cellulaire.
   5. Des tubes à bouchon lâche et incuber les échantillons pendant 4 heures à 37 ° C avec 5% de CO _2.
3. Analyse par cytométrie en flux
   1. Ouvrez le programme d'acquisition de données pour la cytométrie de flux. Mettre en place modèle d'acquisition avant d'échantillonner acquisition.
   2. Cliquez sur l'outil Dot-Plot dans la palette d'outils. Tracez une foscatter rward (FSC) vs diffusion latérale (SSC) parcelle. Définissez les paramètres tension FSC et SSC à échelle linéaire.
   3. Sélectionnez les seuils les plus bas du FSC et SSC autorisés par le cytomètre. Appliquer les seuils de 200 et 50 pour le FSC et SSC, respectivement.
   4. Dans le FSC vs SSC terrain, dessiner une grille G1 qui comprend les monocytes, les granulocytes et les cellules dendritiques, et exclut les débris, les cellules et les lymphocytes du sang rouge.
   5. Cliquez sur l'outil Histogramme dans la palette d'outils. Dessinez un FL2 (canal de fluorescence rouge) histogramme. Utilisez un échantillon de contrôle négatif pour définir la ligne de base des signaux FL2 et un échantillon de contrôle positif pour dessiner une porte d'inclure tous les événements positifs DsRed.
   6. Sur le panneau de commande fluidiques du cytomètre, régler le mode fluide à "RUN" et le débit à "HI" (environ 60 pi / min). Acquérir 10.000 événements pour chaque échantillon.
   7. Déterminer le phénotype chiot en mesurant le pourcentage de cellules positives DsRed de la grille G1.

2. Induction de l'inflammation de la peau dans pIL1-DsRed Souris

1. Anesthetize souris par voie intrapéritonéale (ip) injection d'un cocktail anesthésique contenant 100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine, et 1 mg / kg d'acépromazine. souris anesthésiés de façon adéquate ne montrent pas la patte arrière retrait pincement de l'orteil.
2. Appliquer la crème d'épilation à la surface dorsale des deux oreilles de la souris. Attendre 30 secondes à 1 minute. Essuyez la surface de l'oreille avec du coton mouillé à l'eau et laisser sécher à l'air.
3. Mesurer l'épaisseur de l'oreille en utilisant un micromètre et remplacer la souris dans une cage séparée. Observer jusqu'à la récupération de l'anesthésie (~ 15-30 min). Pour résoudre l'inflammation cutanée induite par le produit d'épilation, laisser la souris se reposer pendant 3 jours avant l'expérimentation plus poussée est effectuée.
4. Préparer 1,25% (p / v) OX en dissolvant 16,7 mg de OX dans 1 ml d'acétone et on mélange 750 ul d'une solution / acétone OX avec 250 ul d'huile d'olive. Préparer la solution de véhicule en mélangeant 750 ul d'acétone avec 250 &# 181; l d'huile d'olive.
5. Re-anesthésier la souris par injection ip de cocktail anesthésique (2.1). Mesurer l'épaisseur de l'oreille comme avant.
6. Appliquer 12,5 pi de 1,25% OX sur chaque côté de l'oreille droite. Appliquer 12,5 pi de véhicule d'huile solution acétone / olive sur chaque côté de l'oreille gauche.
7. Gardez la souris séparée de la cage camarades jusqu'à guérison complète pour empêcher l'insulte à ses oreilles par d'autres souris, puis remplacer la souris dans sa cage d'origine et retourner au centre d'hébergement des animaux.
   NOTE: L'épilation peut entraîner une inflammation mineure de la peau suite par le changement de l'épaisseur de l'oreille. Cette inflammation mineure sera résolu 3 jours plus tard confirmé par l'épaisseur de l'oreille normale. Après application topique pendant 24 heures, les oreilles OX traités montrent significative (p <0,01) gonflement solution du véhicule par rapport oreilles seuls traités.

3. Étiquetage des neutrophiles dans pIL1-DsRed Souris

REMARQUE: marquage in vivo des neutrophiles par une faible dose de fluorescence-conjugué spécifique neutrophiles mAb suit un protocole récemment mis au point ^19. Les injections rétro-orbitaire sont réalisées selon un protocole établi avec quelques modifications ^24.

1. Préparer l'anti-Ly6G solution de travail en diluant mAb 10 pi de 0,5 mg / ml d'Alexa Fluor 647 conjugué anticorps monoclonal anti Ly6G (clone 1A8) dans 90 ul de tampon phosphate salin (PBS).
2. Transférer 100 ul de solution de travail anti-Ly6G mAb (50 pg / ml) dans une seringue d'insuline U-100 avec une aiguille de calibre 28.
3. Anesthetize un adulte pIL1-DsRed souris par injection ip du cocktail anesthésiant décrit précédemment (2.1). Placez l'abdomen de la souris anesthésiée sur une planche de travail propre.
4. Appliquer une pression vers le bas douce à la partie dorsale de la peau et ventrale à un oeil de la souris pour faire saillie partiellement le globe oculaire de la prise.
5. Placez délicatement l'aiguille, biseau vers le bas, à un angle d'environ 30 ° au niveau du canthus médial dans le rétro-orbitalsinus.
   NOTE: L'opérateur peut sentir la pression, la pénétration et la résistance soulagée une fois que les inserts des aiguilles dans le sinus.
6. Lentement et doucement injecter 100 pi d'anti-Ly6G mAb solution (5 ug mAb / souris / injection) dans la souris de travail. Retirer rapidement l'aiguille. Une petite quantité de sang suggère une injection réussie.
7. Appliquer immédiatement 1,25% OX et une solution de véhicule sur le droit et les oreilles gauche de la souris.
8. Au bout de 8 h, administrer 100 ul d'anticorps anti-Ly6G solution fraîchement préparée de mAb de travail (5 pg de mAb / souris / injection) par injection rétro-orbital dans la même souris.
9. Pour visualiser les vaisseaux sanguins, immédiatement avant l'imagerie, administrer 100 ul de 30 mg / ml d'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dextran (150 kDa) par injection de rétro-orbital.

4. Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage dans PIL-1-DsRed Souris

1. Anesthetize souris avec injection ip de cocktail anesthésique (2.1).0; Appliquer une pommade vétérinaire aux yeux de souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie pour l'imagerie.
   1. Préparer 1 ml d'une demi-dose du cocktail anesthésiant en diluant 500 pi d'un cocktail anesthésiant original avec un volume égal de PBS.
   2. Transfert demi-dose de cocktail anesthésique à 1 ml seringue avec une aiguille de calibre 27 papillon.
   3. Insérez l'aiguille de papillon dans l'abdomen de la souris par voie intrapéritonéale et fixer l'aile de papillon à l'abdomen en collant.
2. Placer une lamelle couvre-objet en verre au centre de la scène d'image. Collez les bords de la lamelle pour le maintenir en place.
3. Placer une goutte de PBS sur la surface ventrale de l'oreille de souris, ainsi que sur la lamelle.
4. Position anesthésié la souris avec son oreille sur la lamelle. Monter la pointe de l'oreille, face dorsale vers le bas, en prenant en sandwich l'oreille entre la lamelle et une lame de verre, également maintenu en place par du ruban adhésif.
5. Tourner sur un multi-laser fluorescence microscope confocal et tous les e connexesquipment. Éteignez les lumières des chambres pour minimiser l'exposition de la lumière ambiante.
6. Ouvrez le logiciel d'acquisition d'image. Sélectionnez les canaux laser pour la détection de colorants fluorescents dans le menu Liste Dye.
7. Réglez la mise au point sur ​​la peau de l' oreille enflammée par l' observation des signaux verts des vaisseaux sanguins et des signaux rouges des DsRed ⁺ cellules à travers l' oculaire.
8. Effectuez un balayage rapide avec une vitesse de balayage de 2 ms / pixel et résolution de 512 × 512 pixels. Sélectionnez un pseudocolor pour chaque canal dans le menu Live View. Réglez le bouton de mise au point pour définir la fin et commencer à l'emplacement de la numérisation.
9. Effectuer des analyses lentes avec une vitesse de balayage de 4-8 microsecondes / pixel et résolution de 800 × 800 ou 1.024 × 1.024 pixels. Régler la haute tension, le gain et le décalage sur chaque canal individuel afin de maximiser l'intensité des signaux tout en évitant la saturation (pixels rouges). Il devrait y avoir seulement quelques pixels rouges dans chaque canal.
10. Créer des séries d'images en trois dimensions par balayage ee oreille peau commençant superficiellement dans la couche cornée et en progressant vers le bas avec x, y, z des volumes de 317 um x 317 um x 30 um (objectif 40X), 635 pm x 635 pm x 30 pm (objectif 20X), soit 1,270 um x 1270 um x 50 um (objectif 10X) à 2 pm z-étapes.
    NOTE: Le stratum corneum est la couche la plus externe de l'épiderme et peut être facilement localisé en fonction de son signal d'autofluorescence forte.
11. Dans des expériences d'imagerie time-lapse, d'enregistrer des images en trois dimensions toutes les 2 ou 4 min pour un maximum de 8 heures.
12. Par intermittence, comme la souris commence à se remettre de l'anesthésie, a noté basée sur l'observation des moustaches de secousses, administrer 5 - 10 pi de l'anesthésie demi-dose cocktail à travers l'aiguille de papillon.
    NOTE: Soyez prudent de la dose d'anesthésie - surdosage peut entraîner la mort de la souris. Alternativement, l'anesthésie par inhalation dans un bocal pourrait être appliqué à la souris pour l'anesthésie de courte durée et uncône de nez pourrait être utilisé pour l'imagerie à long terme.
13. Retirez la souris anesthésiée de la scène lorsque l'imagerie est terminée. Détachez bande et retirer l'aiguille de papillon de l'abdomen de la souris. Retour de la souris dans une cage séparée dans l'installation de logement des animaux.
    NOTE: Pour l'imagerie à court terme (<1 h), les souris récupérer pleinement de l'anesthésie rapidement 1-3 h. Pour l'imagerie à long terme (~ 8 h), les souris récupèrent lentement, avec une période de récupération typique de 12-16 h. Ainsi, l'administration de l'eau par voie orale est recommandée au moins plusieurs fois au cours de la période de récupération pour prévenir la déshydratation sévère.
14. Processus ensembles de données d'imagerie, le suivi des cellules individuelles, génèrent des voies de migration, et de calculer la directivité et la vitesse de migration des cellules en utilisant l' image logiciel d'analyse ^25.

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Résultats

Criblage des souris pIL1-DsRed est effectuée sur la base du signal de fluorescence de DsRed phénotypiques produite par les leucocytes du sang périphérique en utilisant la cytométrie de flux. Stimulation par le LPS est connu pour induire la production d' IL-1β dans les cellules myéloïdes , y compris les neutrophiles, les monocytes et les cellules dendritiques ^26-28. Ainsi, les leucocytes isolés sont incubés avec LPS pendant 4 heures avant de cytométrie en flux an...

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Discussion

Le but de cette étude est de développer une technologie pour surveiller le processus de neutrophiles amorçage chez les animaux vivants, qui n'a pas encore été remplies par les techniques actuellement disponibles. Pour atteindre cet objectif, trois méthodes établies sont exécutées: 1) l' induction d' une inflammation cutanée chez des souris IL-1 ß reporter DsRed promoteur-driven comme une mesure de l' amorçage, 2) marquage in vivo des neutrophiles avec de faibles doses de fluorescence...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin sodium	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer	Lonza	10-548E
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F0926
Lipopolysaccharides	Sigma-Aldrich	L4391
Ketamine hydrochloride	Hospira	NDC 0409-2051-05
Xylazine	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
Acepromazine	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
Hair-removal cream	Church & Dwight
Acetone	Fisher Scientific	A16P4
Oxazolone	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody	BioLegend	127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa	Sigma-Aldrich	74817
Butterfly infusion set (27 G needle)	BD	387312
FACSCalibur cytometer	BD
CellQuest Pro software	BD
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Metamorph Software	Universal Imaging