在人类内皮周细胞的相互作用使用基质凝胶插件检测小鼠的体内研究

摘要

我们提出了一个协议使用基质凝胶塞血管生成测定的变化来研究小鼠的人内皮周细胞的相互作用。

摘要

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

引言

血管生成是由该新的血管从预先存在的血管网¹在许多领域从正常发展到疾病形成和是正在进行的研究的焦点的过程。这种动态过程涉及的增殖和血管内皮细胞（ECS）和周构建血管管的朝向需要的氧气和营养输送²点定向招募的迁移。为了研究这个过程需要一个同样动态测定中，最重要的一个可以概括的管道形成三维性质。 体外 3D基质测定已经开发了满足这种需要，并已运作良好，使研究人员以限定在空间和时间上离散的步骤，其中的血管生成发生^{3，4，5，6。}然而，这些体外 3D基质模型限于研究非灌注容器的ð因此缺乏相关的血管生成过程中的关键组件（ 例如，循环增长和抑制因子，非自然的紧张/势力横跨血管床），并不能模拟存在于活组织的复杂环境。为了解决此限制，几个体内血管生成测定法已开发^7，包括基质凝胶塞测定法，其将是我们的报告^8,9的焦点。

基质胶栓法是一个行之有效的体内血管生成实验，呼吁研究人员，因为它提供了一个强大的平台，以测试在不同的血管细胞和物质的作用。基质凝胶是由在37℃下固化成凝胶样物质的Engelbreth-Holm的-群（EHS）小鼠肉瘤细胞系分泌的市售基底膜溶液。基质凝胶可与细胞和/或物质，如生长因子，和麟蹄混合皮下反恐执行局到鼠标。主机内皮细胞会侵入插头超过14天，形成血管网，并成为与宿主的血液灌注。迄今为止，基质凝胶塞测定已专注于内皮细胞行为的血管生成过程中的研究，但是，据我们所知的任何努力尚未作出判断该测定是否可用于共培养的内皮细胞和周细胞研究这两种细胞类型的血管生成过程中如何相互作用。具体地，理解的EC和周之间的关系是用于研究疾病，其中血管损失是病理性的，包括微血管缺血和周围血管疾病^10，11，12有价值。

在这里，我们描述了引入了源于人的周细胞与人类内皮和成纤维细胞生长因子（bFGF）沿着矩阵凝胶混合物的协议。该混合物然后可以皮下注射我ñSCID小鼠的背部，使形成功能齐全，周细胞涂，混合型血管。我们的协议描述了如何制备含有人内皮有或没有人的周细胞，放置到SCID小鼠以及如何分析关键血管生成端点组织切片基质凝胶塞。

研究方案

伦理学声明:涉及动物主题程序已在医学院斯坦福大学医学院被批准的机构动物护理和使用委员会。

注意:动物是在用3％的蒸发器异氟醚和O ₂气体的3％的电源麻醉。眼睛上的药膏兽医使用可能有助于防止干燥时的麻醉下。

1.细胞的制备

1. 培养人类内皮细胞和周细胞的细胞培养100 MM平板用10毫升适当的媒体。更换10毫升新鲜培养基每2 - 1天，直至细胞达到80％汇合。
   1. 培养的内皮细胞（EC）的补充有公司完整内皮细胞培养基（ECM）提供5％牛胎儿血清（FBS），10％青霉素/链霉素和10％的内皮细胞生长补充。
   2. 在补充有公司完整周细胞介质（PM）的培养周细胞供给2％FBS，10％青霉素/链霉素和10％周细胞生长添加剂。
2. 准备细胞混合物
   1. 计算实验组和对照组的所需数量的细胞。
      注:实验组每个插件都包含一个万美元（1×10 ^6）人内皮细胞和二十万（2×10 ^5）周细胞。对于对照组，每组插头包含120万只的人类内皮细胞。阴性对照组仅具有基质凝胶。每个组应该包括至少四塞，这将需要两只小鼠作为插头可注入的小鼠的腰部两侧。三个插头将作为一式三份进行实验和第四可能的情况下，一个发生故障被使用。准备25％的额外细胞相匹配凝胶的额外容量。
   2. 收集和培养板细胞计数。
      1. 要取下电池，取出媒体和室温1X磷酸盐缓冲液（PBS）洗一次。除去PBS，加入1ml 0.25％胰蛋白酶/ 2.21毫摩尔EDTA，并孵育1分钟。加入2洗涤细胞断板毫升培养基，并收集在一个15毫升管。
      2. 算使用根据制造商的说明血球细胞。
      3. 离心细胞的适当数量的成丸，在400×g离心5分钟。为实验组，离心既内皮和周下来连成一片沉淀。

2.基质凝胶制备

1. 解冻完全基质凝胶在4℃下4小时或过夜，得到均匀的溶液。没有混合是必需的。
2. 在1.5ml管分装基质凝胶和储存在4℃。
3. 预寒意无菌1.5毫升管和28克1在4℃毫升胰岛素注射器。注意:保持基质胶冰在任何时候。
4. 混合与bFGF的冷基质凝胶在1的体积比:100（bFGF的终浓度= 0.5微克/毫升; bFGF的储备溶液= 50微克/毫升）通过上下吹打数次混合矩阵凝胶溶液后，在冰上孵育30 - 60分钟b安伏与细胞在步骤3.1中混合。
   注:混合前解冻股票的bFGF。计算所需要的注射插头的数量。例如，每个插头需要200微升基质凝胶。因此，准备25％的额外凝胶。

3.混合矩阵凝胶细胞

1. 对于每个组，重悬细胞沉淀（含有适当的细胞数）与含有bFGF的母质凝胶的计算量。轻轻混匀，避免起泡，直到小鼠注射准备在15ml试管离开冰。

4.鼠标准备

1. 在感应腔麻醉在3％异氟醚5分钟加3％O ₂ 1 SCID小鼠。集中在一个实验组，或2小鼠，一次。
2. 从感应腔在加热垫腹侧移开鼠标，地点向下并迅速经由非再呼吸系整个仁济供给麻醉附加一个吻喷嘴到鼠标的脸ction过程。切换从感应腔室到非再呼吸系统中的气体流量和降低气体压力，以1.5％的异氟醚和1.5％ _的 O _2。
3. 从两侧后区（大约直径1厘米），用剃刀或脱毛霜清除头发。
4. 擦拭用70％酒精垫皮肤区域。
5. 与第二只老鼠4.4 - 返回鼠标感应室，并重复步骤4.2。

5.矩阵注射凝胶

1. 通过附着到非再呼吸系统和加热垫腹侧放置向下准备一只小鼠注射。
2. 加载基质凝胶成预冷的28克1毫升胰岛素注射器一次一个鼠标。
   1. 负载两个插头（每头200微升加25％的额外）到注射器矩阵凝胶的完整的500微升的体积。
   2. 确保将细胞装载到注射器，以防止在CE的3分钟内注入基质凝胶到小鼠从沉降到注射器的侧面并防止基质凝胶从注射器的内部固化LLS。
3. 抬起背部皮肤定位皮下空间，然后注入200微升基质凝胶的缓慢而均匀地进入左肋背面后的皮下空间。
4. 取出注射针慢慢地，小心翼翼地防止基质凝胶漏出注射部位。撞了会形成在注射的部位。擦拭注射部位用酒精垫。
5. 重复注射步骤5.2 - 5.5对小鼠的背部的另一侧，然后离开鼠标在它的后面，持续1分钟，以允许在热垫的基质的凝胶的凝胶化。
6. 介绍了使用永久性标记后14天内，以确定磕碰都颠簸。经过一番头发长回来，它会更容易找到肿块。

6.基质凝胶插件隔离:注射后14天

1. 通过将动物安乐死人道的老鼠s到> 5分钟吸入二氧化碳颈椎脱位，以确保死亡。
2. 卸下鼠标的背部基质胶栓。
   1. 轻轻地取出周围注射部位其插头重复步骤4.3重新长出位于毛。标记线表示原始凸点的皮肤下的大小。
   2. 切除插头分别安装在插头的顶侧和底侧，周围皮肤和肌肉层沿。
      1. 使用精细手术剪，使上即垂直于皮肤插头的明显边界的切口，并通过切向插头下方的肌肉。然后，小心地切绕沿标记的边界的插头的外周。
      2. 拔出插头，保持它夹在皮肤和肌肉层之间。在小烧杯用1X PBS立即冲洗洗去多余的血液。该插件现在可以是固定的（下一步，6.3）。
3. 修复PLU克4％的多聚甲醛。
   1. 将整个插头，包括皮肤和肌肉层，在50ml管中，用25ml 4％的多聚甲醛在室温下24小时而不摆动。第二天，转移插头成25个1ml 70％乙醇的供石蜡包埋之前另外24小时。
      注:处理多聚甲醛慎用。戴手套。

7.石蜡过程中的基质凝胶插件

1. 准备石蜡包埋插头。
   1. 定向插头， 如图1a中 ;放置插头在一个组织盒，使得插头的侧面朝上，皮肤和肌肉层都是横跨组织块的表面，将第一个切片中被切割可见。
2. 石蜡根据标准石蜡包埋协议¹³嵌入插头。
3. 削减8 - 10微米厚的部分离组织块，并安装到显微镜载玻片雅鼎标准石蜡切片协议^13。
4. 贮存于室温阴凉干燥处的幻灯片，直到准备染色。

8. HE染色（H＆E）染色第¹³

1. 通过100％二甲苯传递载玻片两次去paraffinize组织切片，100％的乙醇，95％乙醇，70％的乙醇，最后1×PBS中，每一个用于在室温下5分钟。留在1×PBS中滑动，直到下一个步骤。
2. 吸取100微升H＆E解决方案的上段和孵育1 - 5分钟，或直到有作为在放大10倍的直立光学显微镜下观察细胞细胞核的蓝色和粉红色之间的细胞质鲜明对比。小心不要让H＆E解决方案触及目标。
3. 洗涤H＆E溶液关闭的扣篮在一个大烧杯中的自来水的滑动的滑动件，然后将滑动在烧杯齿条和与2分钟自来水冲洗。
4. 莫五个步骤9.8安装的幻灯片。

9.染色其他幻灯片人类毛细血管和周

1. 通过100％二甲苯传递载玻片两次去paraffinize组织切片，100％的乙醇，95％乙醇，70％的乙醇，最后1×PBS中，每一个用于在室温下5分钟。留在1×PBS中滑动，直到下一个步骤。
2. 煮抗原检索解决方案的部分。
   1. 在一个2升的烧杯中，准备在95℃的加热块上沸腾抗原使用1倍的柠檬酸缓冲液（pH7.0）中检索溶液。
   2. 一旦沸腾，将载玻片在金属机架上，并在20分钟的煮沸抗原修复溶液淹没。
   3. 小心地取出从仍然浸没幻灯片加热块的烧杯中，并让溶液慢慢恢复到室温约30分钟。
   4. 放置在1×PBS中滑动，直到下一个步骤。
3. 方框在封闭缓冲液（章节1×PBS中，5％山羊血清，00.3％的Triton X-100）。
   1. 周围画有PAP笔每一部分的边缘疏水圆。
   2. 放置在用蒸馏水湿度托盘的幻灯片在托盘的底部。
   3. 吸移管将100μl封闭缓冲液到确保所有的组织的切片被流体覆盖（可能需要超过100微升）。
   4. 孵育部分为1小时封闭液。
4. 孵育初级抗体部分。
   1. 备具有两个初级抗体的一个解决方案探测CD31（内皮细胞），并在稀释缓冲液中稀释平滑肌肌动蛋白（周细胞）的每个部分（1×PBS，1％BSA，0.3％的Triton X-100）。
      注意:在此，抗CD31浓度为1:50和抗平滑肌肌动蛋白浓度为1:300。
   2. 孵育切片在4℃下在含有蒸馏水的湿度盘100微升第一抗体过夜。
5. 洗幻灯片三次1X PBST（1X PBS + 0.1％TWEEN20），每次5分钟洗涤。
6. 孵育二级抗体部分。
   1. 准备用荧光团缀合的山羊抗兔第二抗体的溶液以识别在稀释缓冲液中稀释的抗CD31兔抗体。
      1. 注:平滑肌肌动蛋白的第一抗体已结合有CY3荧光团，所以不需要第二抗体染色。山羊抗兔次级抗体浓度为1:250。
   2. 孵育切片1小时，在含蒸馏水的湿度盘100微升次级抗体。
7. 洗玻片三次在1×PBST，每次5分钟洗涤。
8. 装入幻灯片。
   1. 吸取2 - 3滴（〜40 - 60微升）与DAPI核染色防褪色安装解决方案，在每个部分。
   2. 轻轻地放在一个没有。 1.5盖玻片在部分和安装的解决方案，从而允许流体在部分展开和向的边缘盖玻片。轻轻用手指压出气泡可能位于在截面。
   3. 让幻灯片处理之前干燥至少1小时。

10.量化毛细血管密度和结构¹⁴

1. 算在H＆E染色的切片的毛细血管的数目，表示为＃/毫米^2。
   1. 获取下放大40倍一个堂堂正正的光学显微镜四个不同领域的照片。
      注:毛细管被标识为管充满红血球。
   2. 可替代地，代替手工计数毛细管，使用图像分析软件（ 例如，Wimasis图像分析）来量化各种血管生成的参数，如容器数，平均容器的长度和直径，和分支点。
2. 免疫荧光染色切片分析毛细结构。
   1. 获得四个不同领域的图片在一个倒置荧光显微镜与FITC和TxRed过滤立方体。
      1. 在488纳米波长使用FITC立方体图像内皮通过激励和激发在594纳米波长使用TxRed立方体图像周细胞。

结果

基质凝胶塞段的代表性H＆E和免疫荧光染色， 如图2所示。节从EC仅插头显示一些血管被大多不与血液（ 图2左上，黑色箭头），而含有插头灌注既内皮和周显示多个灌注血管直径较大和完整周细胞包裹，就证明了紧邻的CD31阳性内皮细胞阳性的SMA染色。这些结果表明，周细胞中的新生血管形成，而这动态过程可以概括并容易在体内

讨论

基质凝胶塞法已被证明是评估在血管发生， 在体内血管生成和抗血管生成的化合物基因调节，并以补充在体外试验方便和有效的方法。这里，我们详细描述人类血管生成的新颖基质凝胶塞测定该调查期间血管形成的内皮细胞和周细胞之间的相互作用。

还有在这个协议的几个新颖的关键步骤。在低通道（通道1 - 4）细胞是优选的，因为在14天的实验设置中年轻细?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28 G 1 cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 ml screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907