Studio in vivo di Human Interaction endoteliale-pericyte Utilizzando la matrice di gel Plug Assay nel topo

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo per studiare le interazioni umane endoteliali-periciti in mouse utilizzando una variazione del saggio spina angiogenesi gel matrice.

Abstract

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Introduzione

L'angiogenesi è il processo attraverso il quale nuovi vasi sanguigni si formano da una rete vascolare preesistente ¹ ed è il centro di ricerca in corso in molti settori che vanno dallo sviluppo normale alla malattia. Questo processo dinamico coinvolge la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali (EC) e reclutamento di periciti per costruire un tubo vascolare rivolta verso il sito che ha bisogno di ossigeno e nutrienti consegna ^2. Per studiare questo processo richiede un saggio altrettanto dinamico, soprattutto uno che può riassumere la natura tridimensionale di formazione del tubo. In vitro matrice 3D sono state sviluppate per rispondere a questa esigenza e hanno lavorato bene per consentire ai ricercatori di definire i passi discreti nello spazio e nel tempo in cui si svolge l'angiogenesi ^{3, 4, 5, 6.} Tuttavia, questi modelli di matrici in vitro 3D sono limitati a studiare i vasi non perfuso und pertanto mancano componenti critici pertinenti al processo di angiogenesi (ad esempio, la crescita e fattori inibitori, tensione innaturale / forze che circola attraverso il letto vascolare) e non riescono a simulare l'ambiente complesso presente nel tessuto vivo. Per far fronte a questa limitazione, diversi saggi di angiogenesi in vivo sono stati sviluppati ^7, tra cui il saggio spina gel matrice che sarà al centro della nostra relazione ^{8, 9.}

Il saggio spina gel matrice è un vivo test consolidata nell'angiogenesi che fa appello a ricercatori in quanto fornisce una solida piattaforma per testare i ruoli delle diverse cellule e sostanze nell'angiogenesi. Gel Matrix è una soluzione membrana basale disponibile in commercio che viene secreto dalla linea cellulare del mouse sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) che si solidifica in un materiale simile a gel a 37 ° C. Il gel matrice può essere miscelata con cellule e / o sostanze, quali fattori di crescita, e injeCTED per via sottocutanea nel mouse. L'host EC invaderà la spina più di 14 giorni, formare una rete vascolare, e diventare perfusi con sangue dell'ospite. Fino ad oggi, le analisi dei plug gel matrice si sono concentrati esclusivamente sullo studio del comportamento delle cellule endoteliali durante l'angiogenesi, tuttavia, al meglio delle nostre conoscenze nessuno sforzo è stato ancora fatto per determinare se questo test può essere utilizzato cellule endoteliali di co-coltura e periciti per studiare come questi due tipi di cellule interagiscono durante l'angiogenesi. In particolare, la comprensione del rapporto tra EC e periciti è prezioso per lo studio di malattie in cui la perdita dei vasi sanguigni è patologico, tra cui l'ischemia microvascolare e malattia vascolare periferica ^{10, 11, 12.}

Qui, descriviamo un protocollo che introduce periciti di derivazione umana alla miscela di gel matrice con EC umana e il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). Questa miscela può essere iniettata per via sottocutanea in dorso di topi SCID per consentire la formazione di, rivestito periciti, vasi ibridi completamente funzionale. Il nostro protocollo descrive come preparare i tappi di gel matrice contenente cellule endoteliali umane con o senza periciti umani, il posizionamento in topi SCID e come analizzare le sezioni istologiche per gli endpoint angiogenesi critici.

Protocollo

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Stanford University School of Medicine.

NOTA: Gli animali sono sotto anestesia con il 3% isoflurano vaporizzatore e fornitura 3% di O ₂ gas. L'uso del veterinario pomata sugli occhi può aiutare a prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.

1. Preparazione delle cellule

1. Crescere endoteliali e cellule pericyte culture umane in piastre da 100 mm con 10 ml di supporto appropriato. Sostituire 10 ml di mezzo fresco ogni 2 - 3 giorni fino cellule raggiungono l'80% di confluenza.
   1. cellule endoteliali cultura (ECS) in supporto completo delle cellule endoteliali (ECM) integrato con la società forniti 5% di siero fetale bovino (FBS), il 10% di penicillina / streptomicina e 10% supplemento di crescita delle cellule endoteliali.
   2. periciti cultura in mezzi pericyte completa (PM) integrato con società forniti 2% FBS, 10% di penicillina / streptomicina e 10% supplemento di crescita pericyte.
2. Preparare miscele di cellule
   1. Calcolare il numero di cellule necessario per i gruppi trattati e di controllo.
      NOTA: Ogni plug nel gruppo sperimentale contiene un milione (1 x 10 ⁶⁾ EC umana e duecentomila (2 x 10 ⁵⁾ periciti. Per il gruppo di controllo, ogni spina contiene solo 1,2 milioni di EC umani. Il gruppo di controllo negativo ha solo gel matrice. Ogni gruppo deve comprendere almeno quattro spine, che richiederebbero due topi come spine possono essere iniettati in ogni lato di un topo parte bassa della schiena. Tre spine servirebbero come triplice copia per l'esperimento e il quarto potrebbero essere utilizzati nel caso in cui uno non riesce. Preparare 25% in più celle in base al volume extra di gel.
   2. Raccogliere e contare le cellule da piastre di coltura.
      1. Per staccare cellule, rimuovere il supporto e lavare una volta con 1x temperatura ambiente tampone fosfato salino (PBS). Rimuovere PBS, aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina / 2.21 mM EDTA e incubare per 1 min. Lavare le cellule la piastra con l'aggiunta di 2medio ml e raccogliere in una provetta da 15 ml.
      2. Conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro secondo le istruzioni del produttore.
      3. Centrifugare il numero appropriato di celle in una pallina a 400 xg per 5 min. Per il gruppo sperimentale, centrifuga sia ECS e periciti giù insieme in un unico pellet.

2. Matrix Gel di Preparazione

1. Scongelare gel matrice completamente a 4 ° C per 4 ore o durante la notte per ottenere una soluzione omogenea. Non è necessaria alcuna miscelazione.
2. Aliquota gel matrice provette da 1,5 ml e conservare a 4 ° C.
3. Pre-freddo sterili provette da 1,5 ml e 28 G 1 siringhe da insulina cc a 4 ° C. Attenzione: Mantenere il gel matrice sul ghiaccio in ogni momento.
4. Mescolare gel matrice freddo con bFGF in un rapporto volumetrico di 1: 100 (concentrazione finale di bFGF = 0,5 mg / ml; bFGF di soluzione = 50 pg / ml) Dopo miscelazione soluzione di gel matrice pipettando su e giù parecchie volte, incubare su ghiaccio per il 30 - 60 min before miscelazione con le cellule in fase 3.1.
   NOTA: Scongelare lo stock bFGF prima della miscelazione. Calcolare il numero di tasselli necessari per l'iniezione. Per esempio, ogni plug richiede 200 gel matrice ul. Pertanto, la preparazione del 25% gel in più.

3. Matrix Gel Mix con cellule

1. Per ogni gruppo, risospendere il pellet cellulare (contenente il numero di cella appropriata) con il volume calcolato di gel matrice contenente bFGF. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma e lasciare in tubo da 15 ml in ghiaccio fino topi sono preparati per l'iniezione.

4. Preparazione del mouse

1. Anestetizzare 1 topi SCID per 5 min a 3% isoflurano + 3% O ₂ in una camera di induzione. Focus su un gruppo sperimentale, o 2 topi, alla volta.
2. Rimuovere il mouse dalla camera di induzione, posto su un lato ventrale piastra elettrica verso il basso e collegare rapidamente un ugello muso al volto del topo mediante un sistema non-rirespirazione per la fornitura di anestesia in tutto il InjeProcedura ction. Passare il flusso di gas dalla camera di induzione al sistema antireflusso e abbassare la pressione del gas al 1,5% isoflurano e 1,5% O _2.
3. Rimuovere i capelli da entrambe le regioni posteriori laterali (circa 1 cm di diametro) con una crema di rimozione rasoio o dei capelli.
4. Pulire la zona della pelle con un tampone imbevuto di alcool al 70%.
5. Ritorna il mouse per la camera di induzione e ripetere i passaggi 4,2-4,4 con il secondo mouse.

5. Matrix Gel iniezione

1. Preparare un mouse per l'iniezione collegando al sistema di non-rirespirazione e l'immissione sul lato ventrale rilievo di riscaldamento verso il basso.
2. Caricare il gel matrice in un pre-raffreddata 28 G 1 cc siringa di insulina un mouse alla volta.
   1. Caricare il completo volume di 500 ml di gel di matrice per due tasselli (200 pl per alveolo più il 25% in più) nella siringa.
   2. Assicurarsi di iniettare il gel matrice nei topi nel raggio di 3 min di caricare le cellule nella siringa per evitare che il ceLLS da stabilirsi al lato della siringa ed evitare gel matrice solidifichi all'interno della siringa.
3. Sollevare la pelle torna per individuare lo spazio sottocutaneo, quindi iniettare 200 ml di gel di matrice lentamente e in modo uniforme nello spazio sottocutaneo del posteriore posteriore della gabbia toracica.
4. Rimuovere l'ago per l'iniezione lentamente, facendo attenzione a evitare che il gel matrice fuoriuscita del sito di iniezione. Un urto formerà nel sito di iniezione. Pulire sito di iniezione con un tampone di alcool.
5. iniezione Ripetere i passi 5.2 - 5.5 dall'altra parte posteriore del mouse, quindi lasciare il mouse sul retro per 1 min per consentire gelificazione del gel matrice sul cuscino termico.
6. Outline entrambi urti con un pennarello indelebile per identificare l'urto dopo 14 giorni. Dopo un po 'i capelli ricrescono, sarà più facile trovare l'urto.

6. Matrix Isolamento Gel Plug: 14 giorni dopo l'iniezione

1. Euthanize i topi umanamente esponendo l'animales per> 5 min di inalazione di anidride carbonica seguita da dislocazione cervicale per assicurare la morte.
2. Togliere il tappo di gel di matrice dalla schiena del mouse.
   1. Rimuovere delicatamente i capelli ricresciuti intorno al sito di iniezione in cui la spina si trova ripetendo il passaggio 4.3. La linea di riferimento indica la dimensione di urto originale sotto la pelle.
   2. Asportare il tappo insieme con la pelle ei muscoli circostanti strati attaccati ai lati superiore e inferiore della spina, rispettivamente.
      1. Utilizzando le forbici chirurgiche sottili, effettuare un'incisione sul marcato confine della spina che è perpendicolare alla pelle e tagliare al muscolo sotto il tappo. Poi, accuratamente tagliato intorno alla periferia del tappo lungo il confine marcato.
      2. Togliere il tappo, mantenendolo inserita tra gli strati della pelle e dei muscoli. Sciacquare immediatamente in un piccolo bicchiere con 1x PBS per lavare via il sangue in eccesso. La spina è ora pronta per essere fissata (passo successivo, 6.3).
3. Fissare le plug in 4% paraformaldeide.
   1. Inserire l'intera spina, compresi gli strati cutanei e muscolari, in un tubo da 50 ml con 25 ml di paraformaldeide al 4% per 24 ore a temperatura ambiente senza dondolo. Il giorno successivo, trasferire la spina in 25 ml di etanolo al 70% per un altro 24 ore prima di paraffina.
      NOTA: maneggiare con cautela paraformaldeide. Indossare i guanti.

7. Processo di paraffina Matrix Gel Plug

1. Preparare la spina per paraffina.
   1. Orientare la spina come mostrato in figura 1a; inserire la spina in una cassetta tessuto in modo che il lato del tappo rivolto verso l'alto ed entrambi gli strati di pelle e muscolari sono visibili attraverso la superficie del blocco di tessuto che verrà tagliato prima durante il sezionamento.
2. Paraffina incorporare la spina secondo i protocolli standard di paraffina ^13.
3. Tagliare 8 - 10 micron sezioni spesse fuori del blocco dei tessuti e montare su vetrini da microscopio according ai protocolli standard di paraffina sezionamento ^13.
4. Conservare i vetrini in un luogo fresco e asciutto a temperatura ambiente fino al momento per la colorazione.

8. Le sezioni macchia con ematossilina e eosina (H & E) ¹³

1. Sparaffinare le sezioni di tessuto passando le diapositive attraverso 100% xilene due volte, 100% di etanolo, 95% di etanolo, 70% di etanolo ed infine 1x PBS, ciascuno per 5 min a temperatura ambiente. Lasciare i vetrini in PBS 1x fino al passo successivo.
2. Dispensare 100 ul H & E soluzione sulla sezione e incubare per 1-5 minuti, o fino a quando non vi è chiaro contrasto tra i nuclei blu e rosa citoplasma in una cella come visto sotto un microscopio ottico verticale a 10X di ingrandimento. Fare attenzione a non lasciare alcuna soluzione H & E toccare l'obiettivo.
3. Lavare H & E soluzione al largo della slitta da inzuppare il vetrino in un grande bicchiere di acqua di rubinetto, quindi inserire la diapositiva in un rack nel bicchiere e sciacquare con acqua corrente per 2 minuti.
4. momentove al punto 9.8 per montare le diapositive.

9. Stain altre diapositive per Capillari umani e periciti

1. Sparaffinare le sezioni di tessuto passando le diapositive attraverso 100% xilene due volte, 100% di etanolo, 95% di etanolo, 70% di etanolo ed infine 1x PBS, ciascuno per 5 min a temperatura ambiente. Lasciare i vetrini in PBS 1x fino al passo successivo.
2. Lessare le sezioni in soluzione di antigene di recupero.
   1. In un becher 2 L, preparare antigene soluzione bollente recupero utilizzando 1x tampone citrato (pH 7,0) a 95 ° C su una piastra riscaldante.
   2. Una volta ebollizione, mettere i vetrini in un rack di metallo e immergere nella soluzione di recupero dell'antigene bollente per 20 minuti.
   3. Rimuovere con cautela il bicchiere dal blocco di riscaldamento con gli scivoli ancora sommerse e consentire la soluzione per tornare lentamente a temperatura ambiente per circa 30 min.
   4. Porre i vetrini in PBS 1x fino al prossimo passo.
3. Bloccare le sezioni in tampone di bloccaggio (1x PBS, 5% di siero di capra, 0.3% Triton X-100).
   1. Disegnare un cerchio idrofobico intorno ai bordi di ciascuna sezione con una penna PAP.
   2. Porre i vetrini in un vassoio di umidità con acqua distillata sul fondo del vassoio.
   3. Dispensare 100 microlitri tampone di bloccaggio sulle sezioni assicurandosi tutto il tessuto è coperto da fluido (può richiedere più di 100 ml).
   4. Incubare sezioni con tampone di arresto per 1 ora.
4. Incubare sezioni con anticorpo primario.
   1. Preparare una soluzione con due anticorpi primari per sondare ogni sezione per CD31 (ECS) e actina muscolo liscio (periciti) diluito in tampone di diluizione (1x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100).
      NOTA: Qui, la concentrazione di anti-CD31 è 01:50 e anti-liscia concentrazione actina muscolo è 1: 300.
   2. Incubare sezioni notte a 4 ° C con 100 microlitri anticorpi primari in un vassoio di umidità contenente acqua distillata.
5. Lavare i vetrini tre volte in 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) per 5 minuti ogni lavaggio.
6. Incubare sezioni con anticorpo secondario.
   1. Preparare una soluzione con una capra coniugato anticorpo secondario anti-coniglio fluoroforo per riconoscere l'anticorpo di coniglio anti-CD31 diluito in tampone di diluizione.
      1. NOTA: L'anticorpo primario actina muscolo liscio è già coniugato con un fluoroforo CY3, quindi non è necessaria alcuna colorazione anticorpo secondario. Capra anti-coniglio concentrazione di anticorpi secondario è 1: 250.
   2. Incubare sezioni per 1 ora con 100 microlitri anticorpo secondario nel vassoio di umidità contenente acqua distillata.
7. Lavare i vetrini tre volte in 1x PBST per 5 minuti ogni lavaggio.
8. Montare le diapositive.
   1. Pipettare 2 - 3 gocce (~ 40 - 60 microlitri) di antifade soluzione di montaggio con colorazione DAPI nucleare su ogni sezione.
   2. Posizionare delicatamente un no. 1.5 coprioggetto sopra le sezioni e soluzione di montaggio, permettendo al fluido distribuito su sezioni e ai bordila polizza di copertura. usare delicatamente un dito per premere le bolle d'aria che possono essere situati sulla sezione.
   3. Lasciate che le diapositive asciugare per almeno 1 ora prima dell'uso.

10. Quantificare capillare densità e struttura ¹⁴

1. Contare il numero di capillari in H & E sezioni colorate, espressa in # / mm ^2.
   1. Acquisire le foto di quattro diversi campi su un microscopio ottico in posizione verticale sotto 40X di ingrandimento.
      NOTA: Capillari sono identificati come tubi riempiti di globuli rossi.
   2. In alternativa, invece di capillari conteggio manualmente, utilizzare un'immagine software di analisi (ad esempio, Wimasis Image Analysis) quantificare diversi parametri angiogenesi come il numero nave, lunghezza media nave e diametro, e punti di ramificazione.
2. Analizzare struttura capillare nelle sezioni di immunofluorescenza macchiato.
   1. Acquisire le foto di quattro diversi campi su un microscopio a fluorescenza invertitocon il cubo filtro FITC e TxRed.
      1. Utilizzare un cubo FITC di immagine EC da eccitazione a 488 nm di lunghezza d'onda e utilizzare un cubo TxRed di periciti immagine da eccitazione a 594 nm di lunghezza d'onda.

Risultati

Rappresentante H & E e immunofluorescenza colorazione di sezioni spina gel matrice sono mostrati in Figura 2. Sezioni dalla CE solo spine mostrano alcune navi che non sono per lo più perfusi con il sangue (figura 2 in alto a sinistra, frecce nere), mentre le spine contenenti sia EC e periciti visualizzare diverse perfuso navi con diametri maggiori e copertura pericyte completo, come dimostra positivo SMA colorazione immediatamente adiacente alla EC ...

Discussione

Il saggio spina gel matrice ha dimostrato di essere un metodo comodo e potente per valutare regolazione genica nell'angiogenesi, composti angiogenici e antiangiogenici in vivo, e per integrare test in vitro. Qui, descriviamo in dettaglio un romanzo spina saggio gel matrice dell'angiogenesi umana che indaga l'interazione tra cellule endoteliali e periciti durante la formazione dei vasi.

Ci sono alcuni punti nuovi e critici in questo protocollo. Le cellule in bass...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28 G 1 cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 ml screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907