斑马鱼高血糖的急性和慢性模型:评估高血糖对神经发生的影响和放射性标记的分子的生物分布的方法

摘要

这项工作描述了在斑马鱼中建立急性和慢性高血糖模型的方法。目的是调查高血糖对生理过程的影响，如组成型和损伤诱导的神经发生。这项工作还突出了使用斑马鱼跟踪放射性标记的分子（这里，[ ¹⁸ F] -FDG）使用PET / CT。

摘要

高血糖是导致心血管和脑功能障碍的主要健康问题。例如，它与中风后增加的神经系统问题相关，并且显示损害神经源性过程。有趣的是，成年斑马鱼已经成为模拟高血糖/糖尿病并调查组成型和再生神经发生的相关和有用的模型。这项工作提供了开发高血糖斑马鱼模型的方法，以探讨在稳态和脑修复条件下高血糖对脑细胞增殖的影响。使用腹膜内注射D-葡萄糖（2.5g / kg体重）到成年斑马鱼中建立急性高血糖。通过将成人斑马鱼浸入含有水的D-葡萄糖（111mM）中14天来诱导慢性高血糖。对于这些不同的方法描述血糖水平测量。调查高血糖对组成型a的影响的方法通过描述端脑的机械损伤，解剖脑，石蜡包埋和切片切片，并进行免疫组织化学程序，进行再生神经发生。最后，还描述了使用斑马鱼作为研究放射性标记分子的生物分布的相关模型的方法（这里，[ ¹⁸ F] -FDG）使用PET / CT。

引言

高血糖定义为血糖过高。尽管可以反映急性压力的情况，但高血糖也是常常导致糖尿病诊断，糖尿病，胰岛素分泌和/或抵抗的慢性障碍的病症。 2016年全球糖尿病患者人数达到4.22亿，每年有150万人死于该病，成为重大的健康问题¹ 。事实上，不受控制的糖尿病导致影响心血管系统，肾脏和周围和中枢神经系统的几种生理学障碍。

有趣的是，急性和慢性高血糖症可能会改变认知功能，并有助于痴呆和抑郁症2,3,4,5,6。另外，病人入院高血糖与缺血性卒中7,8,9,10,11之间的功能，神经和生存结果较差有关。还显示高血糖/糖尿病影响成人神经发生，一种导致新神经元产生的过程，通过影响神经干细胞活性和神经元分化，迁移和存活^2,12 。

与哺乳动物相比，硬骨鱼如斑马鱼在整个大脑中显示出强烈的神经源性活动，并且在成年期^13,14,15,16期间表现出突出的脑修复能力。值得注意的是，由于neu的持续存在，这种能力是可能的ral干/祖细胞，包括放射状胶质细胞和神经母细胞^17,18,19 。此外，斑马鱼近来已成为研究代谢紊乱的典范，包括肥胖和高血糖/糖尿病^20,21,22 。

虽然斑马鱼是一个公认的高血糖和神经发生模型，但很少有研究调查了高血糖对脑内稳态和认知功能的影响12,23。为了确定高血糖对组成型和损伤诱导的脑细胞增殖的影响，通过腹膜内注射D-葡萄糖产生急性高血糖模型。此外，通过将鱼浸入补充水的水中再现慢性高血糖模型D-葡萄糖¹² 。斑马鱼在研究中表现出很多优势。它们在开发的第一阶段便宜，易于提高和透明，并且其基因组已被测序。在这项工作的背景下，他们还展示了几个额外的优点:（1）他们与人类共享类似的生理过程，使其成为生物医学研究的关键工具; （2）鉴于其广泛而强的神经源性活性，它们可以快速调查高血糖对脑内稳态和神经发生的影响;和（3）它们是替代模型，允许减少研究中使用的哺乳动物的数量。最后，斑马鱼可用作测试放射性标记分子和潜在治疗剂使用PET / CT的生物分布的模型。

以下程序的总体目标是视觉记录如何建立斑马鱼急性和慢性高血糖模型，使用zeb在高血糖条件下评估脑重塑，并使用PET / CT监测放射性标记的分子（这里为[ ¹⁸ F] -FDG）。

研究方案

将成年野生型斑马鱼（ Danio rerio ）保持在标准光周期（14/10h光/暗）和温度（28℃）条件下。所有实验均按照法国和欧洲共同体动物研究指南（86/609 / EEC和2010/63 / EU）进行，并经当地伦理委员会批准进行动物实验。

1.建立斑马鱼急性高血糖模型

1. 通过将400mg三卡因粉末溶解在97.9mL水和2.1mL 1M Tris / HCl缓冲液（pH9）中来制备三卡因（MS-222）的储备溶液。将pH调节至7，并将其等分储存在-20°C。
2. 通过将5mL三卡因（储备溶液）加入到100mL水中（最终三氯氰酸盐浓度:0.02％），为成年斑马鱼准备麻醉剂。
3. 将一个斑马鱼（3至6个月）从其坦克转移到麻醉剂，直至停止移动。
4. 回覆使用切割移液管移动鱼，并在吸收性纸巾上快速干燥。
5. 称重鱼
6. 准备溶解在1X PBS中的D-葡萄糖注射器，注射50μLD-葡萄糖（2.5g / kg体重）。
   注意:例如，0.6克鱼将接受50μL的3％D-葡萄糖/ PBS溶液。
7. 将鱼放在背部，将注射器的针头插入腹腔。
8. 缓慢注射D-葡萄糖/ PBS溶液，然后将鱼放回水中。
9. 检查鱼，直到它完全恢复。将其返回其罐，直到达到进行血糖测量所需的时间。
   注意:注射后1.5小时测量血糖。

2.建立斑马鱼慢性高血糖模型

1. 准备一个2升的清水鱼缸。
2. 将40g D-葡萄糖溶解在2L鱼水中，以得到最终D-葡萄糖浓度111 mM。
3. 在含D-葡萄糖的水中浸入5至7个成年斑马鱼。
4. 每2天更换D-葡萄糖鱼水，以避免细菌或其他微生物的生长。
5. 处理14天后，将鱼短暂置于淡水中，以便在进行血糖值测量之前除去身体外的D-葡萄糖。

3.测量斑马鱼血糖水平

1. 用冰盖上鱼，以便快速安乐死。
   注意:不要使用过量的三卡因，因为这会引起血糖水平的大幅变化。不要将鱼留在冰中太长时间，因为这会导致血液凝结。
2. 用吸收性纸巾擦拭鱼，以除去所有的水，并在血糖测量期间避免血液稀释。
3. 使用解剖镊子取下眼睛，等待眼睛充满血液。
4. 将测试条放在血糖仪上，将条带插入眼睛腔。
5. 测量血糖水平。

4.分析高血糖后脑细胞增殖

1. 解决方案和缓冲:要求和准备
   1. 通过向900mL蒸馏水（dH ₂ O）中加入100毫升10倍的PBS制备1升1x PBS并混合。
   2. 用0.2％洗涤剂（PBS-T;参见材料表）制备1x PBS。
      注意:为了制备1L PBS-T，加入2mL洗涤剂（参见材料表 ）至1L PBS。
   3. 准备乙醇系列（100％x2; 95％; 85％; 70％; 50％和30％）和0.85％NaCl。
   4. 制备封闭缓冲液:含有0.5％至1％奶粉的PBS-T。
      注意:为了制备200 mL封闭缓冲液，在200 mL PBST中加入2 g奶粉。
   5. 准备抗原检索缓冲液，柠檬酸钠。
      注意:为了制备1升柠檬酸钠缓冲液，加入2.94克柠檬酸三钠钠盐脱水至1升dH ₂ 0.将pH调至6，然后再填充至1 L.
   6. 制备4％多聚甲醛-PBS缓冲液，加入4g多聚甲醛至100mL的1x PBS。在58-60℃搅拌下加热，直到其完全溶解。
2. 免疫组织化学样品制备:固定和脱水
   1. 在测量血糖水平后，通过切割鳃后面的头部将头部与身体分开。
      注意:或者，可以将大脑直接提取和冷冻用于其他实验，如mRNA提取。
   2. 在4℃溶解于PBS（PFA-PBS）的4％多聚甲醛中将头固定过夜。
   3. 第二天，在PBS中简单地洗头。
   4. 用显微镜小心解剖脑部。用PBS冲洗固定头，使用针头将头部固定在解剖显微镜下。用镊子去除眼睛和头顶部。 Carefully提取大脑并将其置于1x PBS中。
   5. 用1x PBS连续洗涤30分钟，0.85％NaCl 30分钟，70％EtOH / 0.85％NaCl（v / v）15分钟，70％EtOH 15分钟（两次），85％EtOH 20 min，95％EtOH 20分钟，100％EtOH 20分钟（两次）。在最终的100％乙醇溶液中孵育过夜。
      注意:在石蜡包埋之前，脱水的脑可以在4℃的100％EtOH中保留数月。
3. 免疫组织化学样品制备:石蜡包埋的组织制备
   1. 将大脑放在一个小玻璃烧杯中。
      注意:不要使用塑料容器，因为甲苯会损坏一些塑料。
   2. 取出乙醇并用甲苯代替，因为大脑必须被甲苯完全回收。执行两个30分钟的甲苯浴。
   3. 取出甲苯并将大脑置于嵌入式盒中。将封闭的盒子放在熔化的石蜡系列烧杯中58-60℃（每个石蜡烧杯中30分钟）。打开加温夹层钳。在石蜡浴的末端，取出盒子并将一些液体石蜡倒入模具中。
   4. 将熔化的石蜡倒入模具中，将脑部放入内部。使用加温夹层钳定向大脑，使用大脑的前后方向作为指导。让石蜡在包埋机的冷却部分上硬化。
   5. 由于技术原因，将大脑沿着前后轴定位。在解开石蜡块之后，将其固化并固定在盒子上，使熔融的石蜡以正确的方向进行横向切片。
   6. 将石蜡块插入切片机的手臂。切割50μm厚的部分，直到达到脑样本水平。修剪石蜡块以获得一个空中飞行器，并将切片厚度调整为7μm。使用油漆刷收集石蜡带并将其放在黑色的pap上呃。每3至4节轻轻切割一次。
   7. 将一个滑块放在暖气板上，并用dH ₂ O水将其盖住。
   8. 将切割的丝带轻轻放在水面上。当石蜡带充分展开/展开时，用吸收性纸巾去除水分。最后删除药液。从载玻片上取出水，让它们在30-40℃左右的温暖板上干燥至少3小时。
4. 免疫组化方法
   1. 通过将三分之一的二甲苯容器放置在每个容器中7分钟来除去石蜡。
   2. 将载玻片放入两个100％乙醇的容器中，每次2分钟，然后加入95％EtOH，85％EtOH，70％EtOH和30％EtOH的浴，每次30秒，将部分加水。最后，简单地将幻灯片放在dH ₂ O中，并在PBS中两次，每次5分钟。
   3. 通过在微波炉中的柠檬酸盐缓冲液中孵育切片进行抗原恢复（在500W下2分钟）直到缓冲区开始沸腾。让幻灯片在室温下恢复15分钟。
   4. 在PBST中洗涤三次，每次5分钟，并在含有1％牛奶的PBST中封闭切片45分钟。用阻断缓冲液（ 即 PBST，1％牛奶）稀释的初级抗体（ 例如增殖细胞核抗原（PCNA）用于增殖细胞染色; 1/100）孵育过夜。
   5. 在PBST中洗涤3次，每次5分钟，并用封闭缓冲液和DAPI（1/500）稀释的合适的二次抗体（ 例如山羊抗小鼠Alexa Fluor 488; 1/200）孵育切片90分钟。
   6. 在PBST中洗涤三次，每次5分钟，并用荧光安装介质安装载玻片（参见材料表）。
   7. 使用落射荧光和/或共焦显微镜分析染色。
   8. 定量至少三种不同的感兴趣区域的至少三个连续的脑切片上的脑细胞增殖imals。
      注意:或者，如前所述，可以在琼脂糖中进行脑嵌入进行vibratome切片和自由浮动免疫组织化学。
5. 研究高血糖对脑修复机制的影响
   注意:或者，急性和慢性高血糖症的脑修复调查可以在端脑刺伤伤后进行，如前所述， ^24,25,26 。简述:
   1. 麻醉成人斑马鱼与三叉戟。
   2. 将鱼放在解剖显微镜下面。
   3. 用一只手握住鱼。
   4. 另一方面，将30 G注射器通过颅骨垂直插入右端脑半球的内侧区域。
   5. 将鱼放回鲜鱼水，D-葡萄糖补充水（111mM），或控制鱼水。允许鱼在伤后7天生存。
      注意:有关其余步骤，请参阅步骤4。

5.通过PET / CT在斑马鱼:氟脱氧葡萄糖（[18F] -FDG）中成像放射性标记的分子的生物分布来分析葡萄糖代谢

1. 准备一个含有20 MBq [18 F] -FDG盐水溶液的50μL注射器。
2. 将注射器放在辐射防护屏幕的后面。
3. 麻醉三叉戟的成年斑马鱼
4. 将鱼放在防辐射屏幕的后面。
5. 将[18F] -FDG注入腹膜腔。用小纸巾擦拭注射部位，以防止可能从鱼肚泄漏出来的剩余[18F] -FDG。
6. 使用放射性同位素校准器来测量注射器和组织上包含的剩余活性，以计算精确的注射剂量。
7. 把鱼放在一个ew，用三叶草浸泡的小片吸收性组织轻轻地包裹起来。将吸收性组织的鱼放在PET / CT成像仪的床上。
8. 将床插入PET / CT成像系统并开始采集。
9. 继续进行PET / CT采集。
10. 在程序结束时，将鱼放回少量鲜鱼水中。
    注意:或者，在[18F] -FDG注射后，鱼可以放回少量淡水10分钟至1小时以促进[18F] -FDG的扩散，然后麻醉鱼再次用于PET / CT成像。

结果

使用本文所述的方法，在成年斑马鱼上进行腹膜内注射D-葡萄糖（2.5g / kg体重），并且在注射后1.5小时导致血糖水平的显着增加（ 图1A ）。注射后24小时，D-葡萄糖和PBS注射的鱼¹²之间的血糖水平相似。对于慢性治疗，将斑马鱼浸入D-葡萄糖水（111mM）中，并在其14天治疗结束时变成高血糖（ 图1B ），如前所述

讨论

这项工作描述了在斑马鱼中建立急性和慢性高血糖模型的各种方法。这些程序的主要优点是:（1）允许减少用于研究的哺乳动物数量，（2）易于建立和快速实施，（3）它们是经济的。因此，这些模型允许调查高血糖对大量动物的影响，以研究其对不同生理过程的影响，包括动脉粥样硬化血栓形成，心血管功能障碍，视网膜病变，血脑屏障渗漏以及组成型和再生性神经发生。这项工作描述了如何进...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL Luer-Lok Syringe	BD, USA	309628
4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich, Germany	D8417
7 mL bijou container plain lab	Dutscher, France	080171
D-glucose	Sigma-Aldrich, Germany	67021
Digital camera	Life Sciences, Japan	Hamamatsu ORCA-ER
Disposable base molds	Simport, Canada	M475-2
Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488	Life Technologies, USA	A21206
Embedding center	Thermo Scientific, USA	Shandon Histocentre 3
Fluorescence microscope	Nikon, Japan	Eclipse 80i
Fluorodeoxyglucose (18F-FDG)	Cyclotron, France
Glucometer test strip	LifeScan, France	One-Touch 143 Ultra
Goat anti-mouse Alexa fluor 594	Life Technologies, USA	A11005
In-Vivo Imaging System	TriFoil Imaging, Canada	Triumph Trimodality
Microtome	Thermo Scientific, USA	Microm HM 355 S
Monoclonal mouse anti-PCNA	DAKO, USA	clone PC10
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Germany	P6148-500G
Polyclonal rabbit anti-GFAP	DAKO, USA	Z033429
Slide drying bench	Electrothermal, USA	MH6616
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sodium citrate trisodium salt dehydrate	Prolabo, France	27833.294
Sterile needle	BD Microlance 3	30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91400-14
Superfros Plus Gold Slides	Thermo Scientific, USA	FT4981GLPLUS
Surgical microscope	Leica, France	M320-F12
Tissue embedding cassettes	Simport, Canada	M490-10
Tissue embedding medium	LeicaBiosystems, USA	39602004
Toluene	Sigma-Aldrich, Germany	244511
Tricaine MS-222	Sigma-Aldrich, Germany	A5040
Triton X100	Sigma-Aldrich, Germany	X100-500 mL
Vectashield medium	Vector Laboratories, USA	H-1000
Xylene	Sigma-Aldrich, Germany	534056
Fish Strain	AB
Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter)			For preparing 10X PBS, add the following  salts and complete to 1 liter with distilled water
Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g	Sigma-Aldrich, Germany	746436
Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g	Sigma-Aldrich, Germany	795488
Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g	Sigma-Aldrich, Germany	795410