ゼブラフィッシュにおける高血糖症の急性および慢性モデル：高血糖が神経新生および放射性標識分子の生体内分布に及ぼす影響を評価する方法

要約

この研究では、ゼブラフィッシュで急性および慢性の高血糖モデルを確立する方法について説明します。この目的は、構成的および傷害誘発性の神経発生のような生理学的過程に対する高血糖の影響を調べることである。この研究では、PET / CTを用いて放射標識分子（ここでは、[ ¹⁸ F] -FDG）を追跡するためのゼブラフィッシュの使用法が強調されています。

要約

高血糖は、心血管および大脳の機能不全をもたらす主要な健康問題である。例えば、脳卒中後の神経学的問題の増加に関連し、神経原性プロセスを損なうことが示されている。興味深いことに、成体ゼブラフィッシュは、高血糖症/糖尿病を模倣し、構成的および再生的な新形成を調べるために、関連性のある有用なモデルとして最近出現した。この研究は、恒常性および脳修復条件下での脳細胞増殖に対する高血糖の影響を調べるために、高血糖のゼブラフィッシュモデルを開発する方法を提供する。急性高血糖は、成人ゼブラフィッシュにD-グルコース（2.5g / kg体重）を腹腔内注射することにより確立される。慢性の高血糖は、成体ゼブラフィッシュを水を含むD-グルコース（111mM）に14日間浸漬することによって誘導される。これらの異なるアプローチについて、血糖値の測定値が記載されている。高血糖が構成的に及ぼす影響を調べる方法終脳の機械的傷害を記述し、脳を解剖し、パラフィン包埋し、ミクロトームで切片化し、免疫組織化学的手順を実施することによって再生神経発生を実証する。最後に、PET / CTを用いた放射標識分子（ここでは[ ¹⁸ F] -FDG）の生体内分布を研究するための関連モデルとしてゼブラフィッシュを使用する方法も記載されている。

概要

高血糖は、過剰な血糖値として定義される。急性ストレスの状況を反映することができるが、高血糖はまたしばしば糖尿病の診断、インスリン分泌および/または耐性の慢性障害につながる状態である。 2016年に糖尿病で暮らす成人の数は世界で4億2200万人に達し、毎年150万人がこの病気で死亡し、大きな健康問題となっています¹ 。実際、制御されていない糖尿病は、心臓血管系、腎臓、および末梢および中枢神経系に影響を及ぼすいくつかの生理学的障害を引き起こす。

興味深いことに、急性および慢性の高血糖は認知を変え、認知症およびうつ病の両方に寄与する可能性があります2,3,4,5,6。さらに、患者の入院高血圧症は、虚血性脳卒中後の機能的、神経学的、および生存の転帰に関連している7,8,9,10,11。高血糖症/糖尿病は、神経幹細胞の活動やニューロンの分化、移動、生存に影響を及ぼすことにより、成人の神経新生、新しいニューロンの生成につながる過程に影響を与えることも示された2,12。

哺乳動物とは対照的に、ゼブラフィッシュのようなテンポラリーフィッシュは、脳全体に強い神経性活動を示し、成人期の脳修復能力が13,14,15,16で顕著である。特に、このような能力は、neuの持続性のために可能であるラジアルグリアおよび神経芽細胞を含む幹/前駆細胞17,18,19。さらに、ゼブラフィッシュは、最近、肥満および高血糖症/糖尿病を含む代謝障害を研究するためのモデルとして出現した20,21,22。

ゼブラフィッシュは、高血糖および神経発生のよく知られたモデルであるが、脳恒常性および認知機能に対する高血糖の影響を研究している研究はほとんどない12,23。構成的および傷害誘発性の脳細胞増殖に対する高血糖の影響を決定するために、D-グルコースの腹腔内注射によって急性の高血糖モデルを作製した。さらに、魚を水に浸して慢性高血糖のモデルを再現したD-グルコース¹² 。ゼブラフィッシュは研究において多くの利点を示す。開発の最初の段階で安価で、持ちやすく、透明で、ゲノムの配列が決定されています。この研究の文脈において、それらはまた、いくつかのさらなる利点を示す：（1）それらは人間と同様の生理学的プロセスを共有し、それらを生物医学研究のための重要なツールにする。 （2）脳恒常性および神経新生に及ぼす高血糖の影響を迅速に調べることを可能にする。 （3）それらは代替モデルであり、研究に使用される哺乳類の数の減少を可能にする。最後に、ゼブラフィッシュは、PET / CTを用いた放射性標識分子および潜在的な治療薬の生体内分布を試験するためのモデルとして使用することができる。

次の手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュで急性および慢性の高血糖のモデルを設定する方法を視覚的に文書化し、zeb高血糖状態での脳のリモデリングを評価し、PET / CTを用いて放射能標識分子（ここでは[ ¹⁸ F] -FDG）をモニターすることができる。

プロトコル

成体野生型ゼブラフィッシュ（ Danio rerio ）を標準光周期（14/10時間明/暗）および温度（28℃）条件下で維持した。すべての実験は、フランスとヨーロッパの研究における動物の使用に関するガイドライン（86/609 / EECおよび2010/63 / EU）に従って行われ、地域倫理委員会によって動物実験の承認を受けた。

1.ゼブラフィッシュにおける急性高血糖モデルの確立

1. 400mLのトリカインパウダーを97.9mLの水および2.1mLの1M Tris / HCl緩衝液（pH9）に溶解することによって、トリカインのストック溶液（MS-222）を調製する。 pHを7に調整し、-20℃で保存するために等分する。
2. 成人ゼブラフィッシュの麻酔薬は、トリカイン（原液）5 mLを魚水100 mL（最終トリカイン濃度0.02％）に入れることで調製する。
3. ゼブラフィッシュ（3〜6ヶ月）をタンクから麻酔薬に移して、動きが止まるようにします。
4. 再切断されたピペットを使用して魚を移動させ、速やかに吸収性ティッシュペーパー上で乾燥させる。
5. 魚を体重測定する。
6. 1X PBSに溶解したD-グルコースの注射器を準備し、50μLのD-グルコース（2.5g / kg体重）を注射する。
   注：例えば、0.6 gの魚には50μLの3％D-グルコース/ PBS溶液が与えられます。
7. 魚を背中に置き、シリンジの針を腹腔内に挿入します。
8. ゆっくりとD-グルコース/ PBS溶液を注入し、魚を水中に戻す。
9. それが完全に回復するまで魚をチェックしてください。血糖測定に必要な時間に達するまで、タンクに戻してください。
   注：注入1.5時間後に血糖値を測定します。

2.ゼブラフィッシュにおける慢性高血糖モデルの確立

1. きれいな魚の水の2リットルのタンクを準備する。
2. 2Lの魚の水に40gのD-グルコースを溶解し、最終のD-グルコース濃度を111mMであった。
3. 5〜7匹の成体ゼブラフィッシュをD-グルコースを含む水に浸します。
4. 細菌や他の微生物の増殖を避けるために、2日ごとにD-グルコース魚の水を交換してください。
5. 14日間の処置後、魚を短時間真水に入れて、血糖値測定前に体外のD-グルコースを除去する。

3.ゼブラフィッシュの血糖値の測定

1. 迅速な安楽死のために魚を氷で覆う。
   注意：トリカインを過剰に使用しないでください。これは、血糖値の変動が大きいためです。魚を氷の中にあまりにも長く放置しないでください。これは血液が凝固する原因となります。
2. 魚を吸収性のティッシュペーパーで拭いて水分をすべて除去し、血糖値測定中に血液の希釈を避ける。
3. 解剖鉗子を使用して目を取除き、眼の空洞が血液で満たされるまで待つ。
4. glucometerと私はテストストリップを置くストリップを眼窩に挿入する。
5. 血糖値を測定する。

4.高血糖後の脳細胞増殖の解析

1. ソリューションとバッファ：要件と準備
   1. 蒸留水（dH ₂ O）900 mLに10×PBS 100 mLを加えて1 mLのPBS 1 mLを調製し、混合する。
   2. 0.2％の界面活性剤（PBS-T;材料の表参照）を含む1×PBSを調製する。
      注：1LのPBS-Tを調製するには、1LのPBSに2mLの界面活性剤（ 材料表を参照）を加えます。
   3. エタノールシリーズ（100％×2; 95％; 85％; 70％; 50％および30％）および0.85％NaClを調製する。
   4. ブロッキングバッファー：0.5％〜1％の粉乳を含むPBS-Tを調製する。
      注：200mLのブロッキングバッファーを調製するには、2mLのミルクパウダーを200mLのPBSTに加えます。
   5. 抗原回収バッファー、クエン酸ナトリウムを調製する。
      注：1Lのクエン酸ナトリウム緩衝液を調製するために、2.94gのクエン酸ナトリウムトリナトリウム塩脱水物を1LのdH ₂ Oに添加する.1Lまで充填する前にpHを6に調整する。
   6. 4％パラホルムアルデヒド-PBS緩衝液を調製し、100mLの1×PBSに4gのパラホルムアルデヒドを添加する。完全に溶解するまで、58〜60℃で攪拌しながら温める。
2. 免疫組織化学のためのサンプル調製：固定および脱水
   1. 血糖値を測定した後、鰓の後ろの頭を切断して体から頭を離します。
      注：あるいは、mRNA抽出などの他の実験のために脳を直接抽出して凍結することもできます。
   2. PBS（PFA-PBS）に溶解した4％パラホルムアルデヒド中、4℃で一晩ヘッドを固定する。
   3. 翌日、PBSで頭を簡単に洗う。
   4. 顕微鏡を用いて注意深く脳を解剖する。固定ヘッドをPBSですすぎ、針を用いて解剖顕微鏡下で頭部を固定する。目と頭蓋骨の上部を鉗子で外す。ケアフー脳を抽出し、1×PBSに入れる。
   5. 固定した脳を30分間1×PBS、0.85％NaClで30分間、70％EtOH / 0.85％NaCl（v / v）で15分間、70％EtOHで15分間（2回）、85％EtOHで20分間95％EtOHで20分間、100％EtOHで20分間（2回）洗浄した。最終100％EtOH溶液中で一晩インキュベートする。
      注意：脱水した脳はパラフィン包埋前に4℃で100％EtOH中で数ヶ月間存続します。
3. 免疫組織化学のための試料調製：パラフィン包埋のための組織調製
   1. 小さなガラスビーカーに脳を置きます。
      注記：トルエンはプラスチックを損傷する可能性があるため、プラスチック容器は使用しないでください。
   2. 脳を完全にトルエンで回収しなければならないので、エタノールを取り出してトルエンと交換する。 2つの30分のトルエン浴を行う。
   3. トルエンを取り出し、包埋カセットに脳を置きます。閉じたカセットをパラフィンシリーズのビーカーに5℃8-60℃（各パラフィンビーカー中30分）。暖かい包含鉗子をオンにします。パラフィン浴の終わりに、カセットを取り出し、流動パラフィンを金型に注ぎます。
   4. 溶かしたパラフィンを金型に注ぎ、脳を内部に置きます。脳の前後方向を目安にして、温熱包有鉗子を用いて脳の向きを決めます。パラフィンを埋め込み機の冷却部で硬化させる。
   5. 技術的な理由から、脳を前後軸に沿って配置します。パラフィンブロックを外した後、それを切断してカセット上に固定し、融解したパラフィンを適切な向きにしてトランスバーサルセクショニングを可能にする。
   6. パラフィンブロックをミクロトームのアームに挿入する。脳のサンプルレベルに達するまで、厚さ50μmの切片を切る。パラフィンブロックをトリミングしてトラフェーズを得、セクション厚さを7μmに調整する。絵筆を使ってパラフィンリボンを収集し、それらを黒いパープルに置きますエル。 3〜4つのセクションごとにそれらを静かにカットします。
   7. ウォーミングプレート上にスライドを置き、dH ₂ O水でカバーします。
   8. 穏やかにカットされたリボンを水に置きます。パラフィンリボンが十分に広げられているか展開されている状態で、吸収ティッシュペーパーで水を除去します。最後の滴を機械的に取り除く。スライドから水を除去し、約30〜40℃で少なくとも3時間温めてください。
4. 免疫組織化学手順
   1. パラフィンワックスをキシレンの3つの容器にそれぞれ7分間置いて取り除きます。
   2. 95％EtOH、85％EtOH、70％EtOH、および30％EtOHの各浴をそれぞれ30秒間、続いて2分間、それぞれ100％EtOHの2つの容器にスライドを入れることによって切片を再水和する。最後に、スライドをdH ₂ Oに入れ、PBSで2回、それぞれ5分間短く置く。
   3. クエン酸緩衝液中の切片をマイクロ波（500Wで2分間）でインキュベートすることによって抗原回収を行う。バッファが沸騰し始めます。スライドを室温で15分間回復させる。
   4. PBST中で3回、それぞれ5分間洗浄し、1％ミルクを含むPBST中で45分間セクションをブロックする。ブロッキングバッファー（ すなわち PBST、1％ミルク）で希釈した一次抗体（ 例えば 、増殖性細胞染色のための増殖細胞核抗原（PCNA）; 1/100）で一晩インキュベートする。
   5. ブロッキングバッファーおよびDAPI（1/500）で希釈した適当な二次抗体（ 例えば、ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488; 1/200）を用いてPBST中で3回、それぞれ5分間洗浄し、90分間インキュベートする。
   6. PBST中で3回、各5分間洗浄し、スライドガラスを蛍光性マウント培地でマウントします（材料表参照）。
   7. エピ蛍光および/または共焦点顕微鏡を用いて染色を分析する。
   8. 関心領域の少なくとも3つの連続する脳切片上の脳細胞増殖を、少なくとも3つの別個のイマール。
      注：また、脳の埋め込みは、アガロースで行うことができ、前述の^24のように、ビブラトームの切片化およびフリーフローティング免疫組織化学に進むことができます。
5. 脳の修復メカニズムに対する高血糖の影響の研究
   注：また、先に述べた24,25,26のように、終脳の刺傷傷害後に、急性および慢性の高血糖下での脳修復の調査を行うことができる。簡単に：
   1. 成人ゼブラフィッシュをトリカインで麻酔する。
   2. 魚を解剖顕微鏡の下に光で置きます。
   3. 片手で魚を握る。
   4. 一方、30Gの注射器を頭蓋骨を介して右の頭脳半球の内側領域に垂直に挿入する。
   5. 新鮮な魚の水、D-グルコース補給水（111mM）、または魚の水をコントロールする。魚を傷害後7日間生存させる。
      注記：残りの手順については、手順4を参照してください。

5.ゼブラフィッシュのPET / CTによる放射性標識分子の生体内分布のイメージング：グルコース代謝を分析するためのフルオロデオキシグルコース（[18 F] -FDG）

1. [18 F] -FDGの生理食塩水20 MBqを含む50μLシリンジを準備する。
2. シリンジを放射線防護スクリーンの後ろに置きます。
3. 成人ゼブラフィッシュをトリカインで麻酔する。
4. 魚を放射線防護スクリーンの後ろに置く。
5. [18F] -FDGを腹腔内に注入する。魚の腹から漏れる可能性がある残留[18 F] -FDGの検出を防ぐために、注射部位を小さなティッシュペーパーで拭きます。
6. 放射性同位体キャリブレーターを使用してシリンジと組織に含まれる残りの活性を測定し、正確な注入量を計算する。
7. 魚をew、トリカインを浸した吸収性組織の小さな部分を静かに包みます。 PET / CTイメージャのベッド上に吸収性組織を有する魚を置く。
8. ベッドをPET / CTイメージングシステムに挿入し、収集を開始する。
9. PET / CTの取得を続行する。
10. 手順の最後に、魚を少量の新鮮な魚の水に戻します。
    注：[18 F] -FDG注射後に、魚を少量の新鮮な水に10分〜1時間戻して、[18 F] -FDGの拡散を促進してから魚を再びPETで麻酔することができます/ CTイメージング。

結果

この記事で説明した手順を使用して、成人ゼブラフィッシュでD-グルコース（2.5g / kg体重）の腹腔内注射を行い、注射1.5時間後に血糖値の有意な上昇をもたらした（ 図1A ）。 24時間後の注射では、血糖値はD-グルコースとPBS注射魚の間で類似していた¹² 。慢性的な治療のために、ゼブラフィッシュをD-グルコース水（111mM）に浸?...

ディスカッション

この研究は、ゼブラフィッシュにおける急性および慢性の高血糖モデルを確立するための様々な方法を記載している。これらの手順の主な利点は、（1）研究に使用する哺乳類の数を減らすこと、（2）設置が簡単で迅速に実施できること、（3）経済的であることである。したがって、このようなモデルは、アテローム血栓症、心臓血管機能不全、網膜症、血液脳関門漏出、および構成的およ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL Luer-Lok Syringe	BD, USA	309628
4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich, Germany	D8417
7 mL bijou container plain lab	Dutscher, France	080171
D-glucose	Sigma-Aldrich, Germany	67021
Digital camera	Life Sciences, Japan	Hamamatsu ORCA-ER
Disposable base molds	Simport, Canada	M475-2
Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488	Life Technologies, USA	A21206
Embedding center	Thermo Scientific, USA	Shandon Histocentre 3
Fluorescence microscope	Nikon, Japan	Eclipse 80i
Fluorodeoxyglucose (18F-FDG)	Cyclotron, France
Glucometer test strip	LifeScan, France	One-Touch 143 Ultra
Goat anti-mouse Alexa fluor 594	Life Technologies, USA	A11005
In-Vivo Imaging System	TriFoil Imaging, Canada	Triumph Trimodality
Microtome	Thermo Scientific, USA	Microm HM 355 S
Monoclonal mouse anti-PCNA	DAKO, USA	clone PC10
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Germany	P6148-500G
Polyclonal rabbit anti-GFAP	DAKO, USA	Z033429
Slide drying bench	Electrothermal, USA	MH6616
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sodium citrate trisodium salt dehydrate	Prolabo, France	27833.294
Sterile needle	BD Microlance 3	30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91400-14
Superfros Plus Gold Slides	Thermo Scientific, USA	FT4981GLPLUS
Surgical microscope	Leica, France	M320-F12
Tissue embedding cassettes	Simport, Canada	M490-10
Tissue embedding medium	LeicaBiosystems, USA	39602004
Toluene	Sigma-Aldrich, Germany	244511
Tricaine MS-222	Sigma-Aldrich, Germany	A5040
Triton X100	Sigma-Aldrich, Germany	X100-500 mL
Vectashield medium	Vector Laboratories, USA	H-1000
Xylene	Sigma-Aldrich, Germany	534056
Fish Strain	AB
Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter)			For preparing 10X PBS, add the following  salts and complete to 1 liter with distilled water
Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g	Sigma-Aldrich, Germany	746436
Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g	Sigma-Aldrich, Germany	795488
Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g	Sigma-Aldrich, Germany	795410