在人多能的体外干细胞向滋养层细胞

摘要

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

摘要

胎盘是胚胎发育过程中，开发的第一个器官，并需要对发育中的胚胎的生存。胎盘包括从植入前胚泡的胚外滋养外胚层细胞分化的各种滋养细胞。因此，我们的人胎盘的早期分化事件的认识，是因为对人胚胎的分离和操作的伦理和法律限制的限制。人多能干细胞（hPSCs）是用于调查人类发展的稳健的模型系统，也可以在体外分化成表达各滋养层细胞类型的标志物滋养层细胞。在这里，我们提出了一个详细的协议，用于区分hPSCs到使用骨形态发生蛋白4和激活素/ Nodal信号通路抑制剂的滋养层细胞。该协议生成可以用的siRNA转染各种滋养层细胞类型调查失功能表型或可感染病原体。此外，hPSCs可以进行遗传修饰，然后分化成滋养层祖换的功能增益分析。用于产生人类滋养细胞从hPSCs开始本体外分化的方法克服了与早期的人类胚胎工作的伦理和法律的限制，并且该系统可用于多种应用，包括药物发现和干细胞研究。

引言

怀孕期间胎盘需要胎儿的生长和存活，并促进气体，营养物，废物和激素的母体和胎儿循环之间的交换。哺乳动物胚胎发育过程中形成的第一器官是胎盘，它开始显影6-7天在人类受孕后和在小鼠中^{1，2，3，4} 3.5-4.5天。滋养层细胞是胎盘的最重要的细胞，这些细胞所代表的哺乳动物胚胎的最早谱系分化的事件之一。他们从植入前胚泡的外胚外滋养层细胞产生。我们的胎盘发育的早期阶段的知识是通过模拟早期人类发展的伦理和后勤限制的限制。

在胚胎移植，滋养细胞侵入母体上皮细胞和分化成专门的祖细胞^5。细胞滋养细胞（CTB介）的单核，即融合和分化成合体（SYN包）和绒毛外滋养层细胞侵入（EVTs）未分化的祖细胞，它的锚胎盘在子宫。 SYN包的多核，即合成所需的持续受孕激素影响终末分化细胞。产生EVTs和SYN包的早期分化事件对于胎盘形成所必需的，如在滋养层细胞的损伤导致流产，先兆子痫，宫内生长受限^1。已经开发人类滋养细胞系的类型包括永生个CTB和绒毛膜癌，其产生的胎盘激素和显示侵入属性^6。从人类早期妊娠胎盘的主要滋养层细胞可以分离，但很快细胞DIFferentiate并停止在体外增殖。重要的是，转化和原代细胞系具有不同的基因表达图谱，表明致瘤性和永生滋养层细胞系可能不准确地表示主滋养层^7。此外，这些线是不可能像胎盘滋养层干细胞祖细胞，因为它们是从后级通过第三孕期导出的第一。

有为了研究胎盘的形成和功能的早期事件需要在早期人类滋养细胞体外培养体系稳健。人类胚胎干细胞（胚胎干细胞），它们共享与早期胚胎的内细胞团性质，常用于早期人类的发展模式，包括早期胎盘的形成。人类诱导多能干细胞（iPS细胞）和人类胚胎干细胞可以分化成骨用在铁道部滋养细胞体外phogenic蛋白^{4（BMP4）8，9，10，11，12，13，14，15。}多能细胞用BMP4的滋养层细胞这种转换是特异于人细胞，并广泛用于研究早期人类胎盘的发展，因为它不要求访问人类早期胚胎^9,16。最近，人们发现，在加入抑制剂A83-01（A）和PD173074（P），其阻断SMAD2 / 3和MEK1 / 2信号途径，增加HPSC分化的效率为滋养外胚层样祖细胞，主要的SYN和EVTs，没有广泛代中胚层，内胚层或外胚层细胞^9，17的。使用这些介质的条件下，人类胚胎干细胞分化12天具有相似的基因表达谱从人胚泡期胚胎中分离滋养层细胞和分泌多种胎盘特异性生长激素，支撑该体外模型系统^9，11的有效性。在这里，我们提出了hPSCs 体外分化为使用BMP4 / A / p培养基中的人类祖先滋养了详细的方案。这些条件产生细胞的数量丰富为各种各样的应用，包括RNA测序，基因破坏用的siRNAs，病原体感染，遗传修饰使用脂转染介导的转染。

研究方案

注:对于任何一个人类胚胎干细胞或iPS细胞分化成滋养层祖细胞，生长在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）hPSCs的转变开始分化与BMP4 / A / p之前无饲养了两个通道的条件。这个过程消除了分化细胞的MEF污染。这里，我们提出了人类胚胎干细胞分化的协议，和相同的协议可以被应用到人iPS细胞。

1.文化和辐照小鼠胚胎成纤维细胞的人类胚胎干细胞恢复细胞（MEF）（制剂）

1. 的MEF的γ-辐射
   1. 制成500毫升培养的MEF培养基:DMEM含10％FBS，2mM的L-谷氨酰胺，1×青霉素/链霉素（青霉素/链霉素），和0.1mM非必需氨基酸（NEAA）。
   2. 解冻初级MEFs中的一小瓶，并使用MEF培养基用于培养细胞。展开主MEF中使用MEF培养基30板。
      注意:氧浓度没有此步骤至关重要，因此任一培养箱内生理（4％）或环境（20％）的条件下都可以使用。
   3. 收获MEFS。使用0.25％胰蛋白酶，以从板取下的MEF并将细胞转移到锥形管中。放置的MEF到照射仪器并暴露细胞3500灰色。
      注:的时间量将取决于照射单元内的源的活性。
   4. 悬浮用MEF培养基照射的MEF和计数使用血球细胞的数目。
   5. 沉淀使用离心机该MEF并添加50％的MEF培养基和50％的细胞冷冻培养基（80％FBS和20％的MEF培养基）。等分试样每瓶1×10 ^6个细胞。
   6. 放置在-80℃的冰箱中过夜的辐照MEF小瓶，然后将它们转移到液氮长期贮存。
2. 为解冻冷冻文化MEF中与人类胚胎干细胞
   1. 使500毫升人类胚胎干细胞培养基:DMEM / F-12，用20％血清Replac键相，0.1毫NEAA，2mM的L-谷氨酰胺，10纳克/ ml的bFGF，0.1毫β-巯基乙醇，和1x青霉素/链霉素。
   2. 解冻胚胎干细胞解冻前MEF中一天一小瓶。涂覆6孔板有0.1％明胶，用1毫升每孔中。孵育在室温下至少20分钟，然后取出明胶。
   3. 从存储在液氮中删除的MEF的小瓶中并浸入小瓶在37℃水浴中。观察间歇直到只剩下小冰晶保持小瓶。迅速将小瓶中的内容传送9mL的MEF培养基的15毫升锥形管内。
   4. 通过在200 xg离心离心5分钟沉淀细胞。吸出上清液并重新悬浮在MEF培养基的细胞沉淀。均匀分装的MEF到6孔板中。放板放入37℃的低氧（4％）培养箱中过夜。
3. 在MEF中人类胚胎干细胞的常规培养
   1. 从液氮中取出的胚胎干细胞小瓶用3迅速解冻小瓶7℃水浴。轻轻吸取人类胚胎干细胞到含有9毫升人类胚胎干细胞培养基的15毫升锥形管和自旋向下在200 XG 5分钟。除去培养基并用1ml人类胚胎干细胞培养基中重悬细胞。
   2. 吸从步骤1.2.4准备好的平板的MEF中，加入1 ml人类胚胎干细胞培养基。 ROCK抑制剂Y-27632（10μM）加入到人类胚胎干细胞培养基。转移到人类胚胎干细胞MEF中。
   3. 放置细胞进入37℃的低氧（4％）培养箱中过夜。每天更换人类胚胎干细胞中。刮去分化的细胞用巴斯德移液管，在4X直立显微镜下观察。
   4. 通道的人类胚胎干细胞每4-6天，取决于细胞汇合和人类胚胎干细胞集落的大小。一天前传代MEF中准备一盘。当细胞准备通道，取出胚胎干细胞培养基，并用1毫升的PBS洗孔。
   5. 加入1毫克/毫升胶原酶（预热至37℃），孵育在37℃下5分钟，然后取出胶原酶。 W¯¯灰的细胞用PBS，每孔加入1 ml人类胚胎干细胞培养基中，并手动刮去细胞进入使用5毫升吸管的尖端小团块。转移悬浮细胞团块到一个新的MEF涂覆的孔（多个）。

2.由MEF人类胚胎干细胞的过渡到无饲养的细胞外基质，涂层板条件

1. 准备MEF条件培养基（CM）
   1. 板在T75烧瓶中的照射的MEF在90-100％汇合;重要的是，该MEF密集电镀。观察用显微镜，以确定它们是否已连接于烧瓶底部的细胞（MEF中附上约6小时的电镀或第二天之后）。
      注意:使用显微镜观察时未连接的细胞漂浮在介质中。第二天，除去MEF培养基，并添加25毫升人类胚胎干细胞培养基中缺乏的B-FGF。
   2. 孵化后24小时收集条件培养基。用新鲜培养基每天最多12天进行更换。
   3. 使用0.22微米过滤器过滤所收集的CM。在使用之前，添加新鲜的B-FGF到CM。
      注:CM能够在-80℃冷冻并贮存长达1年。可替代地，在4℃下储存在CM 2周。
2. 从转变对文化MEF中的人类胚胎干细胞的馈线自由外涂层矩阵板。
   1. 细胞外基质的制备用于涂覆组织培养板
      1. 解冻的细胞外基质的在冰上的等分试样（约3-4小时）。使用冰冷的提示，一冷，50ml锥形管中，并DMEM / F12培养基，传送2毫克的细胞外基质的成24毫升冰冷的DMEM / F-12（稀释取决于细胞外基质浓度从供应商）。
      2. 立即锥形管转移50毫升冰和储存于4℃。用于涂覆组织培养板中，稀释细胞外基质的适量添加到孔（例如，将1ml每孔在6孔板）。漩涡涂覆该板，并在室温下孵育至少1小时。
   2. 使用含有B-FGF（10毫微克/毫升）的CM通道的hESCs从该MEF（如在步骤1.3）。
      1. 抽吸以从新印版移除细胞外基质并添加含B-FGF的CM。使用移液管从MEF板传送刮下细胞团块，并将其分装到细胞外涂覆基质板。孵育在37℃的低氧培养箱中过夜。
      2. 更换每日B-FGF介质CM;介质的量将依赖于培养瓶的大小。用2毫升培养基用于一个6孔井。刮去分化的细胞用巴氏吸管。
      3. 人类胚胎干细胞通过每6-7天，如果在显微镜下观察菌落明亮。
         注:生长在涂外基质平板菌落人类胚胎干细胞生长速度比MEF培养的细胞大。
      4. 当无饲养层细胞准备通道，取出介质，通过广告洗采用吸移管吸出，除去PBS丁1ml的PBS中，添加0.5毫克/毫升分散酶（预热至37℃）用移液管，并且在37℃下孵育5分钟。
      5. 加入2毫升的PBS每孔并随后吸移用PBS洗细胞。加入1ml每孔的CM和手动刮去细胞进入使用5毫升吸管的尖端小团块。
      6. 板悬浮细胞团块进入新的细胞外基质包被的平板; 24小时后的细胞要坚持。

3.使用人类胚胎干细胞BMP4 / A / P值分化

1. 准备分化培养基。使用CM（缺乏B-FGF），并添加（鲜）BMP4（50毫微克/毫升）中，A83-01（1μM），和PD173074（0.1μM）。添加在使用前这些抑制剂到CM。
2. 使用无饲养层人类胚胎干细胞的细胞外基质包被的平板1通行增长，定在4％氧气的培养箱内培养。所述第一通道到细胞外涂覆基质的平板后，让细胞附着24小时。第二天，开始分化。除去（含B-FGF）的CM和用含有BMP4 / A / p（2毫升，每孔在6孔板）的CM代替它。继续培养用4％的氧含量的细胞。
3. 更换含BMP4 / A / P中的CM（2毫升/一个6孔板），每2天。吸删除旧的介质，并使用吸管添加新的CM。上添加BMP4和除去的B-FGF（考虑分化第2天）后的第二天，细胞形态发生变化，用显微镜观察时出现大。
   注:未分化细胞，表现出明亮的圆边，将不存在。
4. 收集的细胞以期望的时间点。分化的细胞会停止约2周后分裂。在这段时间内转染细胞（参见下一部分）。

4.转染滋养层细胞与siRNA的或质粒DNA

1. 准备转染滋养层细胞
   1. 对细胞外基质的两个通道从该MEF它们转移后的文化人类胚胎干细胞（见步骤2.2）。使用含有B-FGF人类胚胎干细胞中。
   2. 分裂的胚胎干细胞分化上之前，新的细胞外基质板一天。高细胞融合是非常重要的，所以1分裂细胞:1到一个新的板块/孔，这将确保至少50％汇合第二天。孵育细胞过夜在低氧气培养箱。
      注:胚胎干细胞不需要在这个步骤中被计数。
   3. 第二天，替换用分化培养基的培养基（含有BMP4 / A / P和缺乏B-FGF，使用2-毫升/孔的6孔板的CM）。通过抽吸除去旧培养基并转移使用移液管的新培养基（2ml）中。放置细胞在低氧培养器（4％氧气）中过夜。
2. 使用的siRNA用于基因破坏或使用质粒DNA转染
   1. 分化细胞，直到所需的时间点（之间的天1和14）。转染前一天，trypsinize使用0.05％胰蛋白酶进行5分钟的细胞。他们板至所需汇合（取决于转染试剂协议）到明胶包被的平板（0.1％明胶添加到组织培养板20分钟，并吸出除去）。添加含有BMP4 / A / P（缺乏B-FGF）CM和孵育过夜。
   2. 第二天，新鲜分化培养基添加到细胞中。的siRNA转染使用siRNA转染试剂。对于质粒DNA，使用适当的脂质体试剂。
   3. 按照产品协议为每个转染试剂描述。转移的siRNA脂质体复合物的细胞的每个孔/板，轻轻混合，培养细胞过夜以低氧气培养箱。
      注意:有些转染试剂是由抗生素，需要CM缺乏笔/链球菌抑制。
   4. 第二天，替换以新鲜分化培养基。
   5. 收获细胞的欲望ð时间点（ 例如，24小时，48小时和72小时），利用定量RT-PCR检查基因破坏效率。收获细胞，使用0.05％胰蛋白酶，加入每孔1 ml，在37℃温育5分钟。加入5毫升，每孔MEF培养基的以中和胰蛋白酶。降速细胞在200×g离心5分钟，并使用用于RNA分离细胞沉淀。

滋养层细胞5.病原感染:仙台病毒感染

1. 准备分化的胚胎干细胞
   1. 为从该MEF转让后的细胞外基质两段文化人类胚胎干细胞（见步骤2.2）。使用含有B-FGF人类胚胎干细胞中。
   2. 分裂的胚胎干细胞分化上之前，新的细胞外基质板一天。高蜂窝汇合是重要的，因此分裂细胞1:1到一个新的板/孔，这将确保至少50％汇合的第二天。孵育细胞过夜以低氧气培养箱（4％氧气）。
      注:不需要在这一步要算人类胚胎干细胞。
   3. 第二天，替换用分化培养基（含CM BMP4 / A / P和缺乏B-FGF）和培养过夜以低氧气培养箱（4％氧气）的介质。
2. 滋养层细胞的仙台病毒感染
   1. 所需的分化前一天一天，trypsinize使用0.05％胰蛋白酶的分化细胞（单细胞）5分钟，并将其转移到明胶包被的板。添加分化培养基和在低氧气培养箱孵育过夜。
   2. 第二天，添加培养基感染（这将取决于病毒而变化）。使用CM缺乏含有BMP4 / A / P，以0.5毫升一个6孔板的一个孔青霉素/链霉素。添加仙台病毒对于MOI = 1孵育在低氧气孵化8小时。
   3. 如果更多的时间点是必要的，删除含有病毒的培养基后4小时，并用BMP4 / A / p CM替换它。收集细胞用于RNA分离使用细胞刮。
   4. 通过对所涉及的病毒反应^18个基因进行定量RT-PCR确定病毒感染的效率。

结果

hPSCs的体外分化概述

该体外分化方案开始生长在被转换到无饲养为一个通路（ 图1A）的条件的MEF未分化的人类胚胎干细胞。虽然我们在本协议中所述人类胚胎干细胞的分化，我们使用这个协议成功地分化成iPS细胞滋养层细胞。细胞外基质的过渡去除大部分照射的MEF，这是不可取的，需要人的滋养层细胞...

讨论

我们提出了分化的hESC入滋养层祖细胞的基本步骤。这个协议最近被优化以迅速分化的hESC与除了激活素/ Nodal信号抑制剂，增加分化为滋养层细胞和避免胚层祖细胞，其通常单独用BMP4治疗观察到的产生。该模型BMP4系统允许滋养层沿袭规格和扩展的最早阶段的审查。此外，这种BMP4模型系统也调查滋养层细胞向特定子谱系，使用绒毛膜细胞系和绒毛外滋养细胞系，这是不可能的分化是有用的。 体?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine	Invitrogen	10828-028
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Collagenase Type IV	Invitrogen	17104-019
Rock inhibitor Y27632	Calbiochem	688000
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 µm syringe filter	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator	Heracell/VWR	89187-192	Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4	R&D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R&D Systems	2939/10
PD173074	R&D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.