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Resumo

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Resumo

A placenta é o primeiro órgão a desenvolver-se durante a embriogénese e é necessária para a sobrevivência do embrião em desenvolvimento. A placenta é composto por várias células trofoblásticas que diferenciam a partir de células trofectoderma extra-embrionárias do blastocisto de pré-implantação. Como tal, a nossa compreensão dos eventos diferenciação precoce da placenta humana é limitada por causa das restrições éticas e legais sobre o isolamento e manipulação de embriogênese humana. As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) são um sistema modelo robusto para investigar o desenvolvimento humano e também podem ser diferenciadas in vitro em células trofoblásticas que expressam marcadores de vários tipos de células trofoblásticas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar hPSCs em células trofoblásticas usando proteína morfogénica do osso 4 e inibidores das vias de sinalização / nodais Activina. Este protocolo gera vários tipos de células de trofoblasto que podem ser transfectadas com ARNsipara investigar fenótipos de perda de função ou podem ser infectados com patógenos. Além disso, hPSCs pode ser geneticamente modificado e, em seguida, diferenciaram em progenitores trofoblásticas de ganho-de-função análises. Este método in vitro de diferenciação para geração de trofoblastos humanos a partir de hPSCs supera as restrições éticas e legais de trabalhar com embriões humanos, e este sistema pode ser usado para uma variedade de aplicações, incluindo a descoberta da droga e pesquisa da célula estaminal.

Introdução

A placenta é necessário para o crescimento e sobrevivência do feto durante a gravidez e facilita a troca de gases, nutrientes, produtos residuais e hormônios entre a circulação materna e fetal. O primeiro órgão formado durante a embriogênese dos mamíferos é a placenta, que começa a desenvolver 6-7 dias pós-concepção em humanos e 3,5-4,5 dias em ratos 1, 2, 3, 4. células trofoblásticas são as células mais importantes da placenta, e estas células representam um dos primeiros eventos de diferenciação linhagem de embrião de mamífero. Eles surgem a partir de células trofectoderma extra-embrionárias exteriores do blastocisto de pré-implantação. Nosso conhecimento dos estágios iniciais do desenvolvimento da placenta é limitado por restrições éticas e logísticas sobre a modelagem de desenvolvimento humano precoce.

Durante implantação embrionária, trofoblastosinvadem o epitélio materno e diferenciam-se em células progenitoras especializados 5. Citotrofoblastos (CTBS) são mononucleated, progenitores indiferenciadas que se fundem e se diferenciam em sinciciotrofoblastos (SYNs) e trofoblastos invasivos extravilosas (EVTS), que escora a placenta ao útero. SYNs são multinucleadas, células terminalmente diferenciadas que sintetizam os hormônios necessários para sustentar a gravidez. Os eventos diferenciação precoce que geram TEVs e SYNs são essenciais para a formação da placenta, como deficiências em células trofoblásticas resultar em aborto espontâneo, pré-eclampsia, e intra-uterino restrição de crescimento 1. Os tipos de linhas de células trofoblásticas humanas que foram desenvolvidas incluem imortalizado CTBs e Coriocarcinomas, que produzem hormônios da placenta e exibição propriedades invasivas 6. As células trofoblásticas primárias de placentas primeiro trimestre humanos podem ser isolados, mas as células rapidamente DIFferentiate e parar de proliferar in vitro. Importante, transformada e linhas de células primárias têm diferentes perfis de expressão genética, indicando que linhas de células trofoblásticas tumorigênicos e imortalizadas podem não representar fielmente trofoblastos primários 7. Além disso, essas linhas não são susceptíveis de se assemelham a células progenitoras de células-tronco do trofoblasto da placenta, porque eles são derivados a partir de fases ulteriores primeiro através terceiro trimestres.

Existe uma necessidade de um sistema robusto em cultura in vitro em fase inicial de trofoblastos humanos, a fim de estudar os eventos iniciais da formação e função da placenta. células estaminais embrionárias humanas (hESCs), que compartilham propriedades, com a massa celular interna do embrião pré-implantação, são frequentemente usados ​​para modelar o desenvolvimento humano precoce, incluindo a formação do início placenta. Ambas as células humanas pluripotentes induzidas estaminais (hiPSCs) e hESCs podem ser diferenciados em trofoblastos in vitro utilizando osso MorProteína phogenic 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Esta conversão de células pluripotentes para células trofoblásticas usando BMP4 é específico para células humanas e é amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento da placenta humana cedo porque não exige o acesso a embriões humanos 9, 16. Recentemente, descobriu-se que a adição dos inibidores A83-01 (A) e PD173074 (P), que bloqueiam as vias de sinalização Smad2 / 3 e MEK1 / 2, aumenta a eficiência da diferenciação em células progenitoras HPSC trofectoderma-like, principalmente SYNs e TEVs, sem a ampla geração de mesoderme, endoderme, ou células ectoderma 9, 17 . Usando estas condições médias, hESCs diferenciados por 12 dias têm perfis de expressão gênica similares como células trofectoderma isoladas de embriões blastocisto em estágio humanos e secretam vários hormônios de crescimento específico da placenta, apoiando a validade deste sistema modelo in vitro 9, 11. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a diferenciação in vitro de hPSCs em progenitores trofoblastos humanos utilizando meio de cultura BMP4 / A / P. Estas condições produzem número abundante de células de uma ampla variedade de aplicações, incluindo a sequência de ARN, interrupção de genes utilizando os siRNAs, infecções de agentes patogénicos, e a modificação genética utilizando transfecção mediada por lipofecção.

Protocolo

NOTA: Para a diferenciação de qualquer hESCs ou hiPSCs em progenitores trofoblásticas, hPSCs cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) são a transição para Alimentador livre condições para duas passagens antes de iniciar a diferenciação com BMP4 / A / P. Este processo elimina a contaminação FAE de células diferenciadas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a diferenciação de células estaminais embrionárias humanas, e o mesmo protocolo pode ser aplicado a hiPSCs.

1. Cultura e Recuperação de hESCs em irradiados embrionárias de camundongos Fibroblastos (MEFs) (Preparações)

  1. A irradiação gama, de MEFs
    1. Adicione 500 ml de meio para a cultura das MEFs: DMEM com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1x penicilina / estreptomicina (Pen / Strep), e 0,1 mM ácidos não essenciais (NEAA) amino.
    2. Descongelar um frasco de MEFs primárias e usar o meio MEF para a cultura das células. Expandir as MEFs primárias para 30 placas usando meio de cultura MEF.
      NOTA: As concentrações de oxigénio não são críticos para este passo, assimqualquer um deles pode ser utilizado condições fisiológicas (4%) ou à temperatura ambiente (20%) dentro da incubadora.
    3. Colher o MEFS. Use 0,25% de tripsina para remover as MEFs das placas e transferência das células para um tubo cónico. Coloque as MEFs em um instrumento de irradiação e expor as células a 3.500 cinzas.
      Nota: A quantidade de tempo vai depender da actividade da fonte no interior do aparelho irradiador.
    4. Ressuspender as MEFs irradiados com meio de cultura MEF e contar o número de células utilizando um hemocitómetro.
    5. Agregar as MEFs utilizando uma centrifugadora e adicionar 50% de meio de cultura de células MEF e 50% meio de congelação (80% de FBS e meio de cultura MEF 20%). Aliquota de 1 x 10 6 culas por frasco.
    6. Colocar os tubos MEF irradiada num -80 ° C congelador durante a noite, e depois transferi-los para o nitrogênio líquido para o armazenamento de longo prazo.
  2. Descongelamento MEFs congelados e hESCs para a cultura
    1. Adicione 500 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas: DMEM / F-12 com 20% de soro subsement, NEAA 0,1 mM, 2 mM de L-glutamina, 10 ng / ml de bFGF, ß-mercaptoetanol mM 0,1, e 1x Pen / Strep.
    2. Descongelar um frasco de MEFs um dia antes de descongelar os hESCs. Bata de uma placa de 6 poços com 0,1% de gelatina, utilizando-se 1 ml para cada poço. Incuba-se durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente, e, em seguida, remover a gelatina.
    3. Remover um frasco de MEFs do armazenamento em azoto líquido e imerge o frasco num banho de água a 37 ° C. Assista o frasco de forma intermitente até que apenas pequenos cristais de gelo permanecem. transferir rapidamente o conteúdo do frasco a 9 ml de meio de MEF dentro de um tubo de 15 ml.
    4. Agregar as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio de MEF. Alíquota da MEFs uniformemente sobre uma placa de 6 poços. Coloque a placa em um 37 ° C com baixo oxigênio (4%) incubadora durante a noite.
  3. Cultura de rotina de hESCs em MEFs
    1. Remover um frasco de células estaminais embrionárias humanas a partir de azoto líquido e rapidamente descongelar o frasco utilizando uma 37 ° C banho de água. Pipeta suavemente o hESCs para um tubo cónico de 15 ml contendo 9 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas e girar a 200 xg durante 5 min. Remover o meio e ressuspender as células com 1 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas.
    2. Aspirar o meio MEF da placa preparado no passo 1.2.4 e adicionar 1 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas. Adicionar inibidor da rocha Y-27632 (10 uM) ao meio de células estaminais embrionárias humanas. Transfira os hESCs em MEFs.
    3. Colocar as células em uma incubadora a 37 ° C, baixa-oxigénio (4%) durante a noite. Substituir o meio hESC diária. Raspar células diferenciadas com uma pipeta Pasteur, visualizados sob um microscópio vertical em 4x.
    4. A passagem hESCs a cada 4-6 dias, dependendo da célula de confluência e o tamanho das colónias de células estaminais embrionárias humanas. Prepare um prato de MEFs no dia anterior passaging. Quando as células estão prontas para passagem, remover o meio de células estaminais embrionárias humanas e lavar bem com 1 mL de PBS.
    5. Adicionar 1 mg / ml de colagenase (pré-aquecido a 37 ° C), incuba-se a 37 ° C durante 5 min, e remover a colagenase. Wash as células com PBS, adicionar 1 ml de meio por poço células estaminais embrionárias humanas, e raspar manualmente as células em pequenos aglomerados usando a ponta de uma pipeta de 5 mL. Transferir os aglomerados de células em suspensão em um poço novo MEF-revestida (s).

2. Transição de hESCs de MEFs para Alimentador livre Condições em placas de Matriz Extracelular revestidas

  1. Prepare MEF meio condicionado (CM)
    1. Placa os MEFs irradiados em um frasco T75 a 90-100% de confluência; é importante que as MEFs são densamente plaqueadas. Observar as células utilizando um microscópio para determinar se eles ligado ao fundo do frasco (MEFs anexar aproximadamente 6 horas após o plaqueamento ou no dia seguinte).
      NOTA: células não ligadas flutuar no meio quando observada por um microscópio. No dia seguinte, remova o meio MEF e adicione 25 ml de meio hESC falta B-FGF.
    2. Recolhe-se o meio condicionado após 24 h de incubação. Substitua por meio fresco diariamente, por um período máximo de 12 dias.
    3. Filtra-se o CM recolhidas utilizando um filtro de 0,22 um. Antes da utilização, adicionar fresco B-FGF para a CM.
      NOTA: CM podem ser congeladas a -80 ° C e armazenada durante até 1 ano. Alternativamente, armazenar o CM a 4 ° C durante 2 semanas.
  2. Transição dos hESCs de cultura sobre os MEFs para Alimentador livre placas revestidas com matriz extracelular.
    1. Preparação da matriz extracelular para placas de cultura de tecidos de revestimento
      1. Descongelar uma alíquota de matriz extracelular em gelo (cerca de 3-4 h). Utilizando pontas gelada, uma frio, tubo de 50 ml, e meio DMEM / F12, transferência de 2 mg de matriz extracelular em 24 ml de DMEM gelado / F-12 (a diluição depende da concentração da matriz extracelular do fornecedor ).
      2. transferir imediatamente o tubo de 50 ml de gelo e armazená-lo a 4 ° C. Para placas de cultura de tecidos de revestimento, adicionar a quantidade apropriada de matriz extracelular diluída ao poço (por exemplo, 1 ml por poço numa placa de 6 poços). Agitar para revestir a placa e incubar a temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
    2. hESCs passagem do MEFs (como no passo 1.3), utilizando CM contendo B-FGF (10 ng / mL).
      1. Aspirar para remover a matriz extracelular da nova placa e adicionar CM contendo B-FGF. Transferir os aglomerados celulares raspadas da placa utilizando uma pipeta de MEF e aliquotar em que a placa revestida com a matriz extracelular. Incubar no 37 ° C incubadora de baixo oxigênio durante a noite.
      2. Substitua o CM com meio B-FGF diária; a quantidade de meio dependerá do tamanho do frasco de cultura. Utilizar 2 ml de meio por um de 6 poços bem. Raspar células diferenciadas com uma pipeta Pasteur.
      3. hESCs passagem a cada 6-7 dias, quando as colónias são brilhantes quando vistas sob o microscópio.
        NOTA: hES colónias cultivadas em placas revestidas com matriz extracelular crescer mais do que as células MEF-cultivadas.
      4. Quando as células sem alimentador está pronto para a passagem, remover o meio, lavar por anúncioDing 1 ml de PBS utilizando uma pipeta, aspirado para remover o PBS, adicionar 0,5 mg / ml de dispase (pré-aquecido a 37 ° C) com uma pipeta, e incuba-se a 37 ° C durante 5 min.
      5. Lavam-se as células com PBS, adicionando 2 ml de PBS por poço e depois aspirar. Adicionar 1 ml de CM por poço e raspar manualmente as células em pequenos aglomerados usando a ponta de uma pipeta de 5 mL.
      6. Placa os aglomerados de células em suspensão em novas placas revestidas com matriz extracelular; as células devem aderir após 24 horas.

3. Diferenciação de hESCs Usando BMP4 / A / P

  1. Prepara-se o meio de diferenciação. Uso cm (sem B-FGF) e adicionar (fresco) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM), e PD173074 (0,1 uM). Adicionar estes inibidores para o CM antes da utilização.
  2. Use hESCs livre de alimentação que crescem em placas revestidas com matriz extracelular por 1 passagem, cultivadas dentro de uma incubadora fixado em 4% de oxigênio. Após a primeira passagem em placas revestidas com matriz extracelular,permitir que as células aderir durante 24 horas. No dia seguinte, iniciar a diferenciação. Remover o CM (contendo B-FGF) e substituí-lo com CM contendo BMP4 / A / P (2 ml por poço numa placa de 6 poços). Continuar a cultura das células, utilizando os níveis de oxigénio de 4%.
  3. Substituir o CM contendo BMP4 / A / P (2 ml / poço, para uma placa de 6 poços) cada 2 dias. Aspirar para remover o meio velho e adicionar novo CM usando uma pipeta. No segundo dia após a adição e remoção de BMP4 B-FGF (considerado o dia diferenciação 2), a morfologia celular será alterado, aparecendo maior quando observada por um microscópio.
    NOTA: indiferenciada de células que exibem bordas arredondadas brilhantes, não estará presente.
  4. Coletar células em pontos de tempo desejados. células diferenciadas vai parar de se dividir após cerca de 2 semanas. células transfectar durante este período de tempo (veja a próxima seção).

4. A transfecção de células trofoblásticas com ARNsi ou DNA de plasmídeo

  1. Preparar células trofoblásticas para transfecção
    1. hESCs cultura para duas passagens na matriz extracelular após transferi-los a partir das MEFs (veja o passo 2.2). Use meio hESC contendo B-FGF.
    2. Dividir os hESCs para uma nova placa de matriz extracelular, um dia antes diferenciação. confluência celular elevada é importante, por isso dividir as células de 1: 1 para uma nova placa / poço, o que vai garantir, pelo menos, 50% de confluência no dia seguinte. Incubar as células durante a noite na incubadora de baixo oxigênio.
      NOTA: hESCs não precisa ser contado durante este passo.
    3. No dia seguinte, substituir o meio com o meio de diferenciação (CM contendo BMP4 / A / P e falta B-FGF, utilizando 2 ml / poço de uma placa de 6 poços). Remover o meio antigo por aspiração e transferir o novo meio (2 ml) usando uma pipeta. Colocar as células numa incubadora de baixo oxigénio (4% de oxigénio) durante a noite.
  2. As transfecções usando siRNAs para disrupção do gene ou utilizando ADN plasmídeo
    1. Diferenciar as células até que o desejado tempo-ponto (entre os dias 1 e 14). O dia antes da transfecção, as células trypsinize usando 0,05% de tripsina durante 5 min. Placa-los para a confluência desejada (dependendo do protocolo de reagente de transfecção) para uma placa revestida com gelatina (adicionar 0,1% de gelatina a uma placa de cultura de tecidos durante 20 min e aspirado para remover). Adicionar CM contendo BMP4 / A / P (falta B-FGF) e incubar durante a noite.
    2. No dia seguinte, adicionar meio fresco diferenciação às células. SiRNAs transfectar utilizando um reagente de transfeco de siARN. Para ADN de plasmídeo, usar um reagente de lipofectamina apropriado.
    3. Seguir o protocolo do produto como se descreveu para cada um dos reagentes de transfecção. Transferir os complexos siRNA-lipofectamina a cada / placa poço de células, misture delicadamente e cultura das células durante a noite em uma incubadora de baixo oxigênio.
      NOTA: Alguns reagentes de transfecção são inibidos por antibióticos, que exigem CM falta Pen / Strep.
    4. No dia seguinte, substitua com a mídia diferenciação fresco.
    5. Colher as células no desejod pontos de tempo (por exemplo, 24 horas, 48 horas e 72 horas) para verificar a eficiência ruptura do gene usando RT-PCR quantitativo. Para as células de colheita, a utilização de 0,05% de tripsina, a adição de 1 ml por poço e incubar durante 5 min a 37 ° C. Adicionar 5 ml de meio de MEF por poço para neutralizar a tripsina. Girar as células a 200 xg durante 5 min e usar o sedimento de células para isolamento de ARN.

Infecção 5. Pathogen de células trofoblásticas: Infecção viral Sendai

  1. Prepare hESCs para a diferenciação
    1. hESCs cultura para duas passagens na matriz extracelular, após a transferência das MEFs (veja o passo 2.2). Use meio hESC contendo B-FGF.
    2. Dividir os hESCs para uma nova placa de matriz extracelular, um dia antes diferenciação. confluência celular é alta células importantes, assim divididas 1: 1 para uma nova placa / poço, o que vai garantir, pelo menos, 50% de confluência no dia seguinte. Incubar as células durante a noite em uma incubadora de baixo oxigênio (4% de oxigénio).
      NOTA: hESCs não precisa ser contado durante esta etapa.
    3. No dia seguinte, substituir o meio com o meio de diferenciação (CM contendo BMP4 / A / P e falta B-FGF) e a cultura durante a noite numa incubadora de baixo oxigénio (4% de oxigénio).
  2. Infecção virai de células trofoblásticas Sendai
    1. Um dia antes do dia desejado diferenciação, as células diferenciam trypsinize (para células individuais) usando 0,05% de tripsina durante 5 min e transferi-los para uma placa revestida com gelatina. Adicionar meio de diferenciação e incubar durante a noite em uma incubadora de baixo oxigênio.
    2. No dia seguinte, adicionar meio de infecção (isto irá variar dependendo do vírus). Uso CM falta de Pen / Strep contendo BMP4 / A / P, utilizando-se 0,5 ml para um poço de uma placa de 6 poços. Adicionar vírus Sendai para MOI = 1. Incubar durante 8 horas numa incubadora de baixo oxigênio.
    3. Se pontos de tempo adicional é necessário, remover o meio contendo vírus após 4 horas e substituí-la por BMP4 / A / P CM. coletar célulaspara isolamento de RNA usando um raspador de células.
    4. Determinar a eficiência da infecção virai através da realização de qRT-PCR para genes envolvidos na resposta viral 18.

Resultados

Visão geral de diferenciação in vitro de hPSCs

Este protocolo de diferenciação in vitro começa com hESCs indiferenciadas cultivadas em MEFs que estão a transição para Alimentador livre condições para uma passagem (Figura 1A). Enquanto nós descrevemos a diferenciação de hESCs neste protocolo, usamos esse protocolo para diferenciar com sucesso hiPSCs em células trofoblásticas. A tr...

Discussão

Nós apresentamos os passos básicos para a diferenciação de hESCs em progenitores trofoblastos. Este protocolo foi optimizado recentemente para diferenciar rapidamente hESCs com a adição de inibidores da Activina / Nodal sinalização, aumentar a diferenciação de células trofoblásticas e evitando a geração de células progenitoras da mesoderme, que são tipicamente observadas com o tratamento BMP4 sozinho. O sistema modelo BMP4 permite a análise das primeiras fases de especificação trophoblast linhagem hum...

Divulgações

The authors declare that they have no competing financial interests.

Agradecimentos

This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/F12Invitrogen11330-057
Knock Out Serum ReplacementInvitrogen10828-028This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAAInvitrogen11140-050
FBSInvitrogen16000-044
L-GlutamineInvitrogen10828-028
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140-155
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
B-FGFMilliporeGF-003
DMEMInvitrogen11965-118
DispaseInvitrogen17105-041
Collagenase Type IVInvitrogen17104-019
Rock inhibitor Y27632Calbiochem688000
Irradiated CF1 MEFsGlobalStem6001GMEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 µm syringe filterMilliporeSLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubatorHeracell/VWR89187-192Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4R&D Systems314-BP-01M
A 83-01R&D Systems2939/10
PD173074R&D Systems3044/10
RNAiMaxInvitrogen13778150
TrizolThermoFisher15596026Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9Roche6365779001
MatrigelCorning356231This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.

Referências

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