对于检测磁力搅拌器方法<em&gt;旋毛虫</em&gt;幼虫肌肉样品

摘要

旋毛虫病的人在许多国家预防全球是基于消化，其中的磁力搅拌器方法被认为是黄金标准的方法，从易感动物肌肉样品的实验室检查。

摘要

旋毛虫病是人类一种使人衰弱的疾病，被感染了旋毛虫属的线虫幼虫动物的生的或未煮熟的肉类消费量造成的。全球人类感染的最重要来源是野味及猪肉或猪肉制品。在许多国家，人类旋毛虫病的预防是基于肌肉样本的易感动物尸体的人工消化的方式识别受感染的动物。

有基于肉的消化，但磁力搅拌器方法被认为是金标准的几种方法。此方法允许肌肉样品和随后的过滤和沉降步骤的酶消化后的检测旋毛虫通过显微镜。虽然这种方法不需要特殊的和昂贵的设备，就不能使用的内部控制。因此，严格的质量管理应applie整个试验D。目前的工作的目的是要提供详细的操作说明和方法来分析的基础上，欧盟参考实验室寄生虫和旋毛虫德国国家参考实验室的经验的关键控制点。

引言

属旋毛虫寄生线虫可在全球范围内的食肉动物和杂食的哺乳动物，鸟类和爬行动物的横纹肌进行检测。这些人畜共患线虫可以从猪，马及人的时候生的或半生肉和肉类衍生产品，以及野生动物摄入。此人畜共患可以是在人类特征在于特异病征性体征和症状， 例如腹泻，发烧，眶周水肿和肌痛和可能的并发症，如心肌炎，血栓栓塞性疾病和脑炎¹一种严重的疾病。

旋毛虫是野生和家养动物旋毛虫感染的最普遍的病原体，导致大部分人类感染全世界。在欧洲，北非和西非，和西亚， 旋毛虫britovi是人类感染的另一个来源。此外，另外十个类群较少通常报告为致病人类疾病和剂在世界的不同地区被发现，通常在野生动物^2。除了野生动物如野猪，熊，海象和獾，猪代表了人类感染的全球最重要的来源。

为防止旋毛虫病的最好方法就是从吃生肉产品不要和煮任何肉类，尤其是野味到安全温度（> 65℃1分钟， 即从粉红肉的颜色变成棕色的核心肉产品^）3。欧盟和美国农业部已指定冷冻和烹调时间和温度，可以用来杀死旋毛虫幼虫肉^4,5猪肉制品。此外，对于旋毛虫在肉及肉制品灭活建议由国际委员会发表的旋毛虫病"外部参照"> 6。在欧洲，除了引进的商业猪群那里旋毛虫感染的风险可以忽略不计控制住房条件，人类旋毛虫病的预防是基于易感动物⁴肌肉样品的实验室检查。

对于食品安全而言，消化试验是在肉^3,7直接检测旋毛虫的唯一可靠方法。即使有消化测定的几个变型中，磁力搅拌器的方法是国际公认的参考方法^3，4，7。该测定是基于在横纹肌组织的检测旋毛虫 。肌肉样品的酶消化和随后的过滤和沉淀步骤， 三棱后chinella幼虫通过显微镜鉴定。根据贸易义务和国家立法，也有磁力搅拌器方法的一般协议的小变化，众说纷纭。在这里，技术细节是根据欧盟要求的^4，ISO规格^8，信息和通信技术指导^6，和欧盟参考实验室的寄生虫（EURLP）的经验和德国的参考实验室旋毛虫 。

研究方案

1.准备

1. 样品采集
   注意:可用于单个或合并肌肉样品的磁性搅拌器方法。
   1. 从适当的好发部位，并以适当量⁹收集样品。请参阅该国要求或信息和通信技术，世界动物卫生组织或ISO的建议。
      1. 对于欧盟，例如，采取从隔膜支柱1g的样品在过渡到国内的猪的强壮有力的一部分。确保所有的肌肉样本不含所有的脂肪和筋膜。
   2. 如果舌头测试，删除之前测试的表面层。
   3. 请注意，如果样品被冻结，因为大多数旋毛虫不抗冻和死亡后解开，是消化不太耐倾向于坚持容器壁，从而降低检测灵敏度。
      注意:如果冻结，加倍为L样本量东和增加沉降时间（见下文）。
2. 消化液的制备
   1. 添加25％的盐酸（16±0.5毫升），以2升46预热自来水 - 48℃到3升的玻璃烧杯中。过低的温度会导致消化不完全;过高的温度停用胃蛋白酶的酶学性质。
   2. 放置一个搅拌棒的烧杯中，并搅拌一预热板溶液（46 - 48℃）。
   3. 添加10±0.2克胃蛋白酶（1:10,000 NF，1:12500 BP公司，2000 FIP）到酸性溶液中。
      注意:胃蛋白酶的质量是最重要的和酶的活性必须由生产者进行认证。对于实验室安全原因，并保持胃蛋白酶活性，增加消化液的组件的顺序必须坚持。
3. 肌肉样品制备
   1. 砍在搅拌机或粉碎机百克肌肉样本。为了方便BLEN丁，加2毫升预热水样品和以最大速度融合为2 - 3秒。
   2. 第二混合前，打开搅拌机和混合碗缘缘的底部，并重复交融的顶级传送任何肌肉样本。继续以2连发混合 - 3秒，直到肉没有明显的碎片依然存在。
      注:太少混合，可能会导致消化不完全，而过多的混合可以在样品⁶损坏旋毛虫存在。

2.程序

1. 肌肉样本消化
   1. 传送1升消化流体成圆筒。转移绞肉放入烧杯中，并在消化流体用勺子或叉子传播。彻底用500mL的预热消化流体进3升烧杯中漂洗搅拌器盖子，叶片和搅拌器碗。
      注:可导致SENS的损失不完全漂洗itivity。
   2. 用铝箔覆盖烧杯，并保持44一恒定温度 - 46℃，用一温度计监测。
   3. 炒出的消化液30分钟，无飞溅创建了深刻的漩涡，直到肉颗粒消失。根据测试肉（野生动物如肉）的类型，增加消化时间直至最多60分钟。
2. 过滤和消化流体的沉降
   1. 以确定未消化的组织的量，调整刻度为零，在使用前称量筛，并注意其重量。筛应清洁，没有任何组织的粒子，这可能阻碍旋毛虫到达沉降漏斗。检查分液漏斗垂直平整。
   2. 消化后，小心地倒入通过180微米筛消化液到分离玻璃漏斗。分离玻璃漏斗的宽度不应bË长度大于55％，使良好的幼虫沉淀。请注意，以避免任何溢出。
   3. 为了避免灵敏度降低，彻底冲洗玻璃烧杯中，并从一个挤压洗涤瓶用约200毫升自来水的筛和漂洗水转移到沉淀玻璃漏斗。小心仔细冲洗3升烧杯中的边缘。提起筛子，彻底筛下冲洗的面积。
3. 未消化的组织量的确定
   注意:由于在该方法的执行错误，肌肉组织可以保持在筛上，以及筋膜和结缔组织这是难消化。未消化的组织的量在第一10分钟沉淀步骤（见2.5）来测定。这允许大约30分钟的筛干，残留水会影响未消化的组织所确定的权重。
   1. 广场上规模纸巾，并权衡与undiges筛特德组织。
   2. 从未消化组织筛子过滤重量减去前筛的重量。如果起始样品重量的不超过5％保留在筛（ 即 5克/ 100克原料）在消化过程被认为是令人满意的。
   3. 如果未消化的组织的量超过5％时，重复使用新鲜肌肉样品的测试。如果剩余的组织主要是由未消化的肌肉组织的和新鲜样品不可用，再次消化未消化遗体和除了原始样品检查。
4. 消化液的沉淀
   1. 保持过滤消化流体在分液漏斗中30分钟。如果不受干扰，在旋毛虫会沉淀在漏斗的底部。
   2. 如果使用冷冻的样品，增加沉降时间为最多60分钟。
   3. 一旦沉积完成后，完全打开活塞分液漏斗中，让至少40消化液毫升迅速跑出来，放入量筒（80毫升，如果肌肉样品已经先前冻结）。
   4. 首先，让一半的流体的进入气缸，然后在相反的方向完全打开活塞，以允许10毫升消化流体的通过。最后，在另外10毫升相反的方向打开活塞。此过程可确保旋毛虫不会被困在水龙头。
      注意:需要足够的速度，以避免残留在分液漏斗中的幼虫，降低灵敏度。
5. 气缸中的消化流体的沉降
   1. 离开气缸中的沉淀10分钟，以允许幼虫沉积物。通过用移液管抽吸，而不会干扰10mL的沉积物除去30毫升上清液。
   2. 以减少样品中的组织的纤维的量，30毫升的自来水中添加的沉积物和离开另一个10米英寸重复，直到液体是明确的。
   3. 除去上清液，转移至10毫升洗净泥沙，以网格化培养皿或幼虫计数盆地。冲洗用10mL自来水筒，然后将水添加到样品中。
      注意:在样品中作为大量碎片能够防止旋毛虫 （ 图1）的标识，如果需要的话应进行进一步的洗涤步骤，。
6. 镜检
   1. 使用trichinoscope或立体显微镜具有可调强度的子级透射光源在一个15至20倍的放大倍率的洗涤步骤后，立即以检查样品。
   2. 浇样品放入网格培养皿后，检查由电网盘/盆系统网格。如果没有发现犯罪嫌疑人的结构，轻轻移动在网格培养皿或幼虫计数盆地流体以循环的方式让任何旋毛虫拉rvae，这潜在地忽略，在培养皿的中心积聚。重复检查。
   3. 如果发现可疑的结构，提高放大倍数40 - 100X。从盘/盆用移液器除去旋毛虫 ，并与90％的乙醇的管收集。
   4. 完整的菜已经被审查后，重复上述步骤，从盘/盆的轻轻摇动开始。重复该过程至少三次或直到没有更多的幼虫被找到。
   5. 计数幼虫的数目。关联到肌肉组织的量测试和本为每克（LPG）的幼虫。
   6. 如果太多的幼虫存在于消化流体以确定幼虫数可靠地，返回包含幼虫量筒中的流体，从挤压洗瓶用自来水冲洗，并留下幼虫沉降至底部。
   7. 一个10分钟沉降时间后，降低上清液到规定体积（ 例如10毫升）中。以确定确切体积，转移上清液到新的筒用吸管。
   8. 通过剧烈摇晃液均匀暂停幼虫。在摇动运动，加入20微升悬浮幼虫12滴到培养皿。
   9. 检查显微镜每下降。确定在240微升的幼虫数和删除的最高和最低计数。推断幼虫的数目，以上清液的总体积（ 例如 ，10毫升）。
      注意:立体显微镜的质量是最重要的为旋毛虫的识别。
   10. 当幼虫在管通过吸移管收集，仔细检查幼虫不粘附在移液管壁而被转移到管中。
       注:从合并的样品阳性结果旋毛虫必须跟踪从池中回原籍的尸体。在这里，池大小应逐步减少直至正面胎体鉴定者tified。样本大小也可以在这个过程中增加以增加灵敏度。其中集体样品的检查产生一个正的或不确定的结果，另外20克样品从每个猪服用。从五头猪各20 g样品汇集并使用所描述的方法检测。以这种方式，从20组的五头猪样本将被检查。当一个合并样品中的五头猪检测旋毛虫 ，将20g样品从该组中的个别猪收集并直到检测原点的正胎体每个单独检查。

结果

消化后，将感染性肌幼虫的形状可以变化，使得识别更加困难。典型形式包括紧密缠绕的幼虫，轻轻地盘绕幼虫或C形或完全解开幼虫（ 图2B - 2C）。每克发现幼虫的数目可以显着变化，并且可以从一个幼虫到几百幼虫范围。

感染性肌幼虫的形态示于图2A。 旋毛虫是0.7至1.5毫米长，宽度大约0.3mm。食管狭窄，有一个略显圆润结束。角质层是光滑的。在体腔内，该stichosome的前半部分，一个结构构成的细长管45至55的大细胞（stichocytes）一排包围的，可以观察到。直肠也是圆的，没有任何突出物或附属物^10,11。

t"的>其他的结构，除了旋毛虫 ，可以肌肉消化后发现的一些例子示于图3A。 - 3F野生动物常常感染其他寄生虫或可用于测试的肌肉样品中由动画的剜过程被污染或无生命的结构/生物。幼虫的长度，前部和后部端部的外观和的stichosome帮助的发生，以不同的线虫属¹²区分。

图1: 旋毛虫后镜检（A）不足和（B）有足够的漂洗步骤。刻度条表示100μm左右。 请点击此处查看大图已经这个数字rsion。

图2: 感染形态旋毛虫显示幼虫（A）的直肠，Stichosome和食道 。消化显示（B）后肌幼虫可能的形状紧密缠绕，轻轻地盘绕动的幼虫和（C）解开幼虫。刻度条表示100μm左右。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3: 肌肉的消化样品中的磁力搅拌器方法后偶然发现的例子。 （A）的鬃毛般的头发野猪发现蚯蚓; （B）从野猪Alaria翅 ; （C）从野猪的肌纤维; （D）Metastrongylus藻。从野猪; 弓首 SP:（E）植物纤维野猪（F）中。幼虫从野猪。刻度条表示100μm左右。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

虽然磁力搅拌器方法可以容易地进行，而不是严格遵守的技术细节导致灵敏度不足，从而危及消费者的健康。关键控制点已经凸显在上面的文字。此外，使用适当的设备是为测试的成功结果至关重要。所有船只应作出的涂有硅，以减少对表面幼虫附着玻璃和枪头。

消化方法的灵敏度取决于在肌肉幼虫密度和肌肉样品的测试的量。为3的幼虫密度- 5液化石油气肌肉组织的，100％的灵敏度被报道，但低于1 LPG的灵敏度下降至^{40％，13。}取决于所测试的宿主动物种类，试验的灵敏度可通过增加样品的使用量得到改善。第i在野生动物nfection负担通常较低，因此大尺寸的样品使用^14。好发部位也宿主动物的不同而不同。这里，一些肌肉组织的下消化率如舌需要被考虑在内，这也可导致更大的样本在尺寸^15。

此外，要明白，磁力搅拌器方法不包括内部控制是重要的。因此，从采样质量保证管理的文档是必不可少的，以获得准确的和精确的结果。实验室性能检测旋毛虫肌肉样品中的质量应在能力测试每个分析师经常参与进行监测。

该方法的进一步限制是由显微镜肌幼虫的最终识别阶段是高度主观和HEAvily依赖于幼虫形态的研究分析师的知识。

绕过这个问题的一个有趣的替代方法是磁力搅拌器方法/过滤器上分离之后幼虫检测通过胶乳凝集试验。不过，根据欧盟法规此方法仅视为等同于家猪的而不是动物，它们在感染风险较高的肉类的测试，如野猪^4。用单克隆抗体幼虫抗原的识别使得测试更加客观，但否认实验室确定每克肉¹⁶的幼虫数的可能性。

磁力搅拌器方法的进一步变化包括机械辅助合并样本消化法/沉淀技术，机械辅助合并样本挖estion方法/过滤器上分离的技术，并为最多至35g技术的合并样品的自动消化方法。这些技术都是基于肉和旋毛虫的可视化及数量的人工消化，但在用于过滤和沉降步骤的设备不同。

分离出的幼虫可以进一步确定在通过分子测试（ 如多重^PCR）17种的水平。根据欧盟法律，所有的阳性样品必须转发国家参考实验室或EURLP为旋毛虫决心。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knife, Scissors, Tweezers			Cutting samples and removing non-digestible tissue
Blender			With a sharp chopping blade
Magnetic stirrer			With thermostatically controlled heating plate
Stirring Rod			Teflon-coated, approximately 5 cm long
Conical glass separation funnel			Capacity of at least 2 L, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation.
Stands, rings and clamps
Sieve			Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh
Funnel			Internal diameter not less than 12 cm, to support the sieves
Glass beaker			Capacity 3 L
Glass measuring cylinder			Capacity 50 to 100 mL, or centrifuge tube
Stereo-microscope			With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table
Petri dishes			9 cm diameter, marked on their undersides into 10 × 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope
Aluminium foil			Alternatively a lid to cover the beakers
25% hydrochloric acid
Pepsin			Strength: 1:10,000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12,500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2,000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/mL
Ethanol			70-90% ethyl alcohol
Tap water			Heated to 46-48 °C before use
Balance			Accurate to at least 0.1 g
Metal tray			Capacity 10 to 15 L, to collect the remaining digestive juice
Pipettes and pipette holder			Different sizes (1, 10 and 25 mL)
Thermometer			Accurate to 0.5 °C, temperature range at least from 20 ° C to 70 °C
Siphon			For tap water