의 검출을위한 자석 교반기 방법<em&gt; 선모충</em근육 샘플에서&gt; 애벌레

요약

많은 나라에서 인간 trichinellosis 방지 전세계 교반기 방법 금 표준 간주되는 소화의 방법에 의해 감염 동물의 근육 샘플의 실험실 시험에 기초한다.

초록

Trichinellosis 인간의 쇠약 질환과 속 선모충의 선충 유충에 감염된 동물의 원시 또는 덜 익힌 고기의 소비로 인해 발생합니다. 인간 감염의 가장 중요한 소스는 전 세계 게임 고기와 돼지 고기 나 돼지 고기 제품입니다. 많은 나라에서, 인간 trichinellosis 예방은 감염 동물 사체로부터 근육 시료의 인공 소화에 의해 감염된 동물의 식별에 기초한다.

고기의 소화하지만, 자석 교반기 방법이 황금 표준으로 간주됩니다에 따라 여러 가지 방법이 있습니다. 이 방법은 근육 샘플 및 후속 여과 및 침전 단계의 효소 분해 후 현미경으로 선모충의 유충의 검출을 할 수 있습니다. 이 방법은 특별한 고가의 장비를 필요로하지 않지만, 내부의 제어 장치는 사용할 수 없다. 따라서, 엄격한 품질 관리는있는 수정되어야한다테스트를 통해 거라고. 본 연구의 목적은 세부 처리 지침 및 기생충에 대한 유럽 연합 (EU) 참조 약국 및 선모충 독일의 국립 참조 연구소의 경험을 바탕으로 애널리스트의 방법의 중요 관리 점을 제공하는 것입니다.

서문

속 선모충의 선충은 전 세계적으로 육식 동물과 잡식 동물 포유류, 조류, 파충류의 가로 무늬 근육에서 검출 될 수있다. 이러한 동물 매개 선충 돼지, 말에서 인간 원료 또는 반 원시 고기와 고기 파생 된 제품을 도달 할 수 있습니다, 게임 동물은 섭취한다. 이 인수 공통 전염병은 pathognomonic 징후와 증상, 예를 들어, 설사, 발열, 눈 주위 부종과 근육통 및 심근염, 혈전 색 전성 질환과 뇌염 ¹ 가능한 합병증을 특징으로 인체에 심각한 질병이 될 수 있습니다.

선모충은 야생 및 국내 동물 선모충 감염의 가장 광범위 병인 에이전트이며, 전 세계적으로 인간 감염의 대부분을 발생합니다. 유럽, 북미 및 서부 아프리카, 서아시아에서 선모충의 britovi 인간 감염의 또 다른 근원이다. 또한 10 개의 다른 분류군 덜 일반적 원인으로보고있다 인간 질병의 에이전트는 일반적으로 야생 동물 ^2, 세계의 다른 지역에서 발견된다. 이러한 멧돼지, 곰, 바다 코끼리와 오소리 등 야생 동물뿐만 아니라, 돼지 고기는 전 세계적으로 인간 감염의 가장 중요한 소스를 나타냅니다.

trichinellosis을 방지하는 가장 좋은 방법은 원시 육류 제품을 먹는 자제하고 고기, 안전 온도 (특히 게임 고기를 요리하다> 65 ° C 1 분 동안, 즉의 핵심에 갈색에 핑크에서 고기 색상을 변경하려면 고기 제품) ^3. 유럽 연합 (EU)과 USDA은 고기 ^{4, 5} T.의 spiralis 유충을 죽이는 데 사용 할 수 있습니다 돼지 고기 제품에 대한 동결 및 조리 시간과 온도를 지정했습니다. 또한, 육류 및 육류 제품에 선모충의 비활성화에 대한 권장 사항은 Trichinellosis에 관한 국제위원회가 발표되었다"외부 참조"> 6. 유럽에서는, 선모충 감염의 위험성을 무시할 상업용 돼지 무리의 제어 하우징 조건의 도입에 더하여, 인간 trichinellosis 예방은 감염 동물 ^사에서 근육 샘플의 실험실 시험에 기초한다.

식품 안전을 위해 소화 분석 고기 ^{3, 7} 선모충 유충의 직접 검출을위한 신뢰할 수있는 유일한 방법이다. 소화 분석의 여러 가지 변형이 있더라도 교반기 방법은 국제적으로 인정 된 기준 방법 ^{3, 4, 7이다.} 이 분석은 가로 무늬 근육 조직에서 선모충의 유충의 검출을 기반으로합니다. 근육 샘플의 효소 분해 및 후속 여과 및 침전 단계 후 트라이chinella 유충은 현미경으로 식별됩니다. 무역 의무와 국내법에 따라, 자석 교반기 메소드의 범용 프로토콜에서 작은 변화의 다수가 있습니다. 여기에, 기술적 인 세부 사항은 유럽 연합 (EU)의 요구 사항 ^4, ISO 규격 ^8, ICT 가이드 라인 ⁽⁶⁾ 및 기생충 (EURLP)에 대한 유럽 연합 (EU) 참조 연구소의 경험과 선모충에 대한 독일의 참조 연구소를 기반으로합니다.

프로토콜

1. 준비

1. 시료 채취
   주 : 교반기 방법은 하나 또는 풀링 근육 샘플을 사용할 수있다.
   1. 적절한 취향 사이트로부터 적당량 ^(9)을 채취. 국가의 요구 사항 또는 ICT, OIE 또는 ISO의 권고 사항을 참조하십시오.
      1. 유럽 ​​연합 (EU)의 경우, 예를 들어, 돼지의 힘찬 부분으로의 전환에 다이어프램 기둥에서 1g의 샘플을 채취. 모든 근육 샘플 모든 지방과 근막이 없는지 확인합니다.
   2. 혀가 테스트되는 경우, 테스트 이전에 표층 제거.
   3. 샘플을 냉동하는 경우 가장 선모충의 유충이 내성 동결과 죽음 이후 풀다하지 않는 한,주의, 소화에 덜 내성 및 감소 분석 감도의 결과로, 컨테이너 벽에 집착하는 경향이있다.
      참고 : 냉동 경우, 리터에서 표본의 크기를 두 배로동쪽으로는 침전 시간 (아래 참조) 증가.
2. 분해 액의 제조
   1. 3 L의 유리 비커에 48 °의 C - 46로 예열 수돗물의 2 L에 25 % 염산 (16 ± 0.5 mL의)를 추가합니다. 불완전 분해의 온도 결과에 너무 낮다; 온도가 너무 높은 펩신의 효소 속성을 비활성화합니다.
   2. 비커에 교반 봉을 놓고 예열 접시에 용액을 교반 (46-48 °에 C를).
   3. (10,000 NF, 1 : 12,500 BP, 2000 FIP 1) 산성 용액에 펩신의 10 ± 0.2 g을 추가합니다.
      참고 : 펩신의 품질은 가장 중요하고 효소 활성이 생산자에 의해 인증을 받아야이다. 실험실 안전을 위해 및 펩신 활성을 유지하기 위해 분해 액 성분의 첨가 순서에 부착되어야한다.
3. 근육 샘플 준비
   1. 믹서 나 분쇄기에 근육 샘플 100g까지 들어온다. BLEN 용이하게하기 위해땡은 샘플을 2 mL의 물을 예열 추가하고 2 최대 속도로 혼합 - 3 초.
   2. 제 블렌딩 전에 믹서를 열고 바닥 반복 블렌딩 블렌딩 그릇 에지 가장자리의 상단에있는 근육 샘플 옮긴다. 고기의 눈에 보이는 조각이 남아 있지 않을 때까지 3 초 - 2 버스트 혼합을 계속합니다.
      참고 : 너무 작은 혼합이 불완전한 소화 될 수 있습니다, 너무 많이 혼합이 샘플 ^6에서 선모충의 유충 존재를 손상시킬 수있다.

2. 절차

1. 근육 샘플 소화
   1. 실린더로 소화 유체의 1 L를 전송합니다. 비커에 다진 고기를 전송하고 숟가락 또는 포크 소화 유체에 보급. 철저 3 L 비커로 예열 소화 액 500 mL로 믹서 뚜껑, 블레이드 및 믹서 그릇을 씻어.
      참고 : 불완전한 세척은 SENS의 손실이 발생할 수 있습니다itivity.
   2. 알루미늄 호일로 비커를 덮고 (44)의 일정한 온도 유지 - 46 °의 C 및 온도계를 모니터링 할 수 있습니다.
   3. 고기 입자가 사라질 때까지 30 분 튀는없이 깊은 소용돌이를 생성하는 소화 액체를 저어. 시험 고기 (야생 동물의 고기 등)의 종류에 따라, 60 분의 최대까지 소화 시간을 증가시킨다.
2. 여과 및 소화 유체의 침강
   1. 소화 조직의 양을 결정하기 위해 0으로 스케일을 조정 사용 전에 자체 무게 및 중량을 참고. 체는 깨끗하고 침강 깔때기에 도달하는 선모충의 유충을 방해 할 수있는 조직 입자의 결여해야한다. 분리 깔때기 수직 수평되어 있는지 확인합니다.
   2. 소화 후, 조심스럽게 분리 된 유리 깔때기에 180 ㎛의 체를 분해 액을 붓는다. 분리 된 유리 깔때기의 폭 ㄴ 안된다전자 길이보다 큰 55 %는 좋은 유충 침강을 허용합니다. 어떤 오버 플로우를 방지하기 위해주의하십시오.
   3. 감도의 손실을 방지하기 위해 철저하게 유리 비커와 스퀴즈 세척 병 수돗물의 약 200 mL를 체를 씻어 침강 유리 깔때기로 헹굼 물을 전송합니다. 조심스럽게 3 L 비커의 가장자리를 씻어주의하십시오. 체를 들어 올리고 철저하게 자체에서 영역을 씻어.
3. 소화 조직 량의 결정
   주 : 상기 방법의 실행에서의 오류로 인해, 근육 조직이 잘 근막과 소화되어 결합 조직으로, 체 상에 남아있을 수있다. 소화 조직의 양은 제 10 분간 침강 단계 (250 참조) 동안 결정된다. 잔류 물이 소화되지 않은 조직의 결정 무게에 영향을 미칠 수 있기 때문에 이것은 자체 건조하는 약 30 분을 할 수 있습니다.
   1. 규모에 종이 타월을 배치하고, undiges으로 자체 무게테드 조직.
   2. 소화되지 않은 조직으로 자체 중량에서 여과하기 전에 자체 무게를 뺍니다. 시작 샘플 중량의 5 % 이하가 자체 (즉, 5g / 100g 원료)에 남아있는 경우, 분해 과정은 양호한 것으로 간주된다.
   3. 소화 조직의 양이 5 %를 초과하는 경우, 새로운 근육 시료를 사용하여 시험을 반복한다. 나머지 조직은 주로 소화 근조직 이루어지는 신선한 샘플을 사용할 수없는 경우, 다시 소화 남아 다이제스트 원래 샘플에 부가 조사한다.
4. 소화 유체의 침전
   1. 30 분 동안 분별 깔대기에서 여과 소화 유체를 유지한다. 그대로두면 선모충의 유충은 깔때기의 바닥에 정착됩니다.
   2. 냉동 된 샘플을 사용하는 경우, 60 분간 최대 침강 시간을 증가시킨다.
   3. 침전이 완료되면 완전히 콕을 열고분액 깔때기의 신속 적어도 40 mL를 소화 유체의리스 (근육 샘플 이전에 냉동 있었다면 80 mL)을 메스 실린더로 도망.
   4. 먼저, 실린더에 유체의 절반을 허용하고 완전히 통과 분해 액 10 ㎖를 허용하도록 반대 방향 스톱 콕을 열어. 마지막으로, 또 다른 10 ㎖에 대한 반대 방향 스톱 콕을 열어. 이 절차는 선모충의 유충이 꼭지에 갇혀되지 않도록합니다.
      주 : 충분한 속도 감도를 감소 분액 깔대기에 남아있는 유충을 피하기 위해 필요하다.
5. 실린더 내 소화 유체 침강
   1. 유충은 침전 수 있도록 10 분 동안 실린더 내의 퇴적물을 남겨주세요. 10 ML의 침전물을 방해하지 않고 피펫으로 흡입하여 30 mL의 상층 액을 제거합니다.
   2. 시료의 조직 섬유의 양을 줄이기 위해, 침전물을 30 mL의 수돗물을 추가하고 다른 10m 떠날액체가 분명하다 때까지. 반복합니다.
   3. 상층 액을 제거하고 10 ㎖가 그리드 화 페트리 접시 또는 애벌레 계산 유역에 침전물을 세척 전송합니다. 10 ML의 수돗물 실린더를 씻어 후 시료에 물을 추가합니다.
      주 : 필요한 경우 시료 파편으로 다량의 선모충 유충 (도 1)의 식별을 방지 할 수 있으며, 상기 세척 단계가 수행되어야한다.
6. 현미경 검사
   1. 즉시 세척 단계 후 샘플을 검사 15 20 배 배율에서 trichinoscope 또는 조정 강도의 하위 단계 전송 광원과 스테레오 현미경을 사용합니다.
   2. 격자 페트리 접시에 샘플을 주입 한 후 그리드에 의해 요리 / 체계적으로 분지 그리드를 검사합니다. 아무 의심 구조가 발견되지 않으면, 부드럽게 모든 선모충 라 할 수 있도록 원형 방식으로 격자 페트리 접시 또는 애벌레 계산 분지에서 유체를 이동잠재적으로 간과했다 rvae은 페트리 접시의 중심에 축적합니다. 검사를 반복합니다.
   3. 용의자 구조가있는 경우, 40 배율을 증가 - 100X한다. 피펫으로 접시 / 분지에서 선모충의 유충을 제거하고 90 % 에탄올로 튜브에 수집합니다.
   4. 완전한 접시가 검사 된 후에는 접시 / 지의 부드러운 흔들림부터의 절차를 반복한다. 적어도 3 회 더 이상 애벌레 때까지 절차를 반복하는 것이 발견된다.
   5. 유충의 수를 계산합니다. 근육 조직의 양과 상관 관계는 테스트 g (LPG) 당 유생으로 존재.
   6. 너무 많은 유충이 안정적으로 애벌레 수를 결정하기 위해 소화 유체에 존재하는 경우, 측정 실린더에 유충을 포함하는 유체를 돌려 스퀴즈 세척 병 수돗물로 씻어,하고 아래로 정착 애벌레를 둡니다.
   7. 10 분 침강 시간 후, 정의 된 볼륨에 뜨는을 감소 (예 :10 ㎖). 정확한 양을 확인하려면, 피펫으로 새 실린더에 뜨는을 전송합니다.
   8. 격렬한 흔들림에 의해 유체에 균일하게 애벌레를 일시 중단합니다. 요동 동안 배양 접시에 20 μL 애벌레 정지 12 방울을 추가합니다.
   9. 현미경으로 각 드롭을 검사합니다. 240 μL의 유충의 수를 결정하고 최고 및 최저 카운트를 삭제합니다. 상등액의 총량 (예를 들어 10 ㎖)에 유충의 수를 추정.
      참고 : 스테레오 현미경의 품질은 선모충의 유충의 식별을 위해 가장 중요하다.
   10. 유충은 피펫으로 튜브에 수집 할 때, 애벌레는 피펫 벽에 부착하지 않았지만 튜브로 전송되어 있는지주의 깊게 확인합니다.
       참고 : 풀링 된 샘플에서 긍정적 인 선모충 결과는 기원의 시체에 다시 풀에서 추적해야합니다. 양 도체가 아이덴 때까지 여기서, 풀 크기는 점진적으로 감소되어야tified. 샘플 크기는 감도를 증가시키는 과정이 증가 될 수있다. 집단 시료의 검사는 양수 또는 불확실한 결과를 생성하는 경우, 추가 20g 샘플은 각각의 돼지에서 가져온 것입니다. 다섯 돼지에서 20g 샘플을 모으고 기재된 방법을 사용하여 검사된다. 이런 식으로 다섯 돼지의 20 그룹의 샘플을 검사한다. 선모충 5 개의 돼지에서 풀링 된 샘플에서 검출 될 때, 20g의 시료를 그룹의 각각의 돼지로부터 수집되고 원래 양 도체가 검출 될 때까지 각각 별도로 검사된다.

결과

소화 후, 감염성 근육 유충의 형상 인식을 더 어렵게 변할 수있다. 일반적인 형태는 단단히 코일 유충, 가볍게 코일 유충 또는 C 형 또는 완전히 uncoiled 유충 (- 2C도 2B)를 포함한다. 그램 당 발견 된 유충의 수는 상당히 다를 수 있으며, 몇 백 애벌레 한 유충에 이르기까지 다양 할 수 있습니다.

감염성 근육 유충의 형태는도 2a에 도시된다. 길이 0.7 ~ 1.5 mm, 폭 약 0.3 mm는 선모충의 유충입니다. 식도는 좁고 약간 둥근 끝이있다. 표피는 부드러운이다. 체강 상기 stichosome의 앞쪽 절반에서, 구조 (45) (55)에 큰 셀 (stichocytes)의 행에 의해 둘러싸인 긴 세관 이루어지는 관찰 할 수있다. 직장 ¹¹ 어떤 예측하지 않고 또한 둥근 또는 ¹⁰ 부속되어.

t "> 기타 구조, 선모충의 유충 외에, 근육 소화 후 발견 될 수있는 몇 가지 예는도 3a에 도시되어있다 -.. 3 층을 야생 동물이 자주 애니메이션으로 내장 적출 과정에서 오염 된 다른 기생충이나 테스트에 사용할 수있는 근육 샘플에 감염되어 또는 무생물 구조 / 생물. 유충의 길이는 전방 및 후방 끝의 모양과 stichosome 도움의 발생은 다른 선충 장군 ^(12)를 구별한다.

그림 1 : (A) 부족 및 (B) 충분한 헹굼 단계 후 선모충 유충의 현미경 검사. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 더 큰이 적이 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 rsion.

그림 2 : 유충 (A)의 직장, Stichosome과 식도 표시 형태론 감염성의 선모충 애벌레. 소화 표시 (B) 후 근육 애벌레의 가능한 모양 단단히 감아 가볍게 애벌레와 (C)를 이동하는 유충을 uncoiled 코일. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 자석 교반기 방법으로 소화 근육의 샘플 후 부대 조사 결과의 예. (A)의 모 형 머리멧돼지에있는 지구 벌레; (B) 멧돼지에서 Alaria의 alata는; (C) 멧돼지에서 근육 섬유; (D) Metastrongylus SP. 멧돼지에서; Toxocara 특검팀 : (E) 식물 섬유는 멧돼지 (F)에서 발견. 멧돼지에서 애벌레. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

교반기 방법을 용이하게 수행 할 수 있지만, 엄격 기술적 세부 사항을 준수하지 않는 것은, 따라서 소비자의 건강을 위태롭게 충분한 감도로 이끈다. 임계 제어 지점은 위의 텍스트에서 강조되고있다. 또한, 해당 장치의 사용은 시험의 성공적인 결과에 매우 중요하다. 모든 선박들은 표면 애벌레의 부착을 감소시키는 실리콘 코팅 유리 피펫 팁 만들어 져야한다.

소화 방법의 민감도는 근육의 유충 밀도 시험 근육 시료의 양에 따라 달라진다. (3)의 유충 밀도 - 근육 조직 5 LPG, 100 %의 민감도가보고 되었으나 한 LPG보다 감도가 40 % ^(13)에 떨어 뜨렸다. 테스트 된 숙주 동물의 종에 따라 시험의 민감도가 사용 시료의 양을 증가시킴으로써 향상시킬 수있다. 제 i야생 동물 nfection 부담 때문에 더 큰 샘플 크기는 ^14을 사용, 일반적으로 낮다. 취향 사이트는 또한 호스트 동물마다 다릅니다. 여기서, 또한 큰 샘플을 초래할 수 혀 고려할 필요 같은 일부 근육 조직의 하부 소화율은 ¹⁵ 크기.

또한, 자석 교반기 방법은 내부 제어를 포함하지 않는다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 따라서, 문서에 대한 샘플링에서 품질 보증 관리는 정확하고 정밀한 결과를 얻기 위해 필수적이다. 근육 샘플 선모충 유충을 검출하는 기관 성능의 품질 능력 시험에서 각 분석 정기적 참여에 의해 모니터링한다.

방법의 또 다른 한계는 현미경으로 근육 애벌레의 최종 식별 단계는 매우 주관적 및 난방입니다입니다심사 분석에 의해 애벌레 형태의 지식에 vily 의존.

이 문제를 회피하는 흥미로운 또 다른 방법은 라텍스 응집 시험으로 애벌레 검출 다음 필터 분리에 자석 교반기 방법 /입니다. 그러나 EU 법규에 따라이 방법은 같은 멧돼지 ^4로 국내 돼지하지만 감염의 위험이 높은 동물 고기의 테스트에 해당하는 것으로 간주됩니다. 모노클로 날 항체와 항원 유생의 식별은 시험보다 대물 수 있지만, 기관 고기를 ¹⁶ 그램 당 유충의 수를 결정하는 가능성을 부정한다.

자석 교반기 방법의 또 다른 변화는 기계적으로 지원 풀링 된 샘플 소화 방법 / 침전 기술, 기계적으로 지원 풀링 된 샘플 발굴 포함필터 분리 기술에 estion 방법 / 최대 35g 기술의 풀링 된 샘플에 대한 자동 소화 방법. 이들 기술은 모두 고기 선모충 유충의 시각화 및 계산의 인공 소화에 기초하지만, 여과 및 침전 단계에 사용되는 기기 상이된다.

분리 된 유충은 또한 분자 시험 (예를 들어, 다중 PCR) ^(17)에 의해 종 레벨에서 식별 될 수있다. EU 법률에 따르면, 모든 긍정적 인 샘플은 선모충 종 판별을 위해 국가 참조 실험실 또는 EURLP에 전달해야합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knife, Scissors, Tweezers			Cutting samples and removing non-digestible tissue
Blender			With a sharp chopping blade
Magnetic stirrer			With thermostatically controlled heating plate
Stirring Rod			Teflon-coated, approximately 5 cm long
Conical glass separation funnel			Capacity of at least 2 L, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation.
Stands, rings and clamps
Sieve			Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh
Funnel			Internal diameter not less than 12 cm, to support the sieves
Glass beaker			Capacity 3 L
Glass measuring cylinder			Capacity 50 to 100 mL, or centrifuge tube
Stereo-microscope			With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table
Petri dishes			9 cm diameter, marked on their undersides into 10 × 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope
Aluminium foil			Alternatively a lid to cover the beakers
25% hydrochloric acid
Pepsin			Strength: 1:10,000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12,500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2,000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/mL
Ethanol			70-90% ethyl alcohol
Tap water			Heated to 46-48 °C before use
Balance			Accurate to at least 0.1 g
Metal tray			Capacity 10 to 15 L, to collect the remaining digestive juice
Pipettes and pipette holder			Different sizes (1, 10 and 25 mL)
Thermometer			Accurate to 0.5 °C, temperature range at least from 20 ° C to 70 °C
Siphon			For tap water