重组昆虫细胞中的mCD1d的蛋白质的生产方法。

摘要

一个方法，准备昆虫细胞和感染杆状病毒重组mCD1d mCD1d四聚体的proteinand生产的目的。

摘要

CD1的蛋白质构成的抗原提呈分子的第三类。他们是细胞表面的糖蛋白，约50 kDa的糖基化，非共价与β2-微球蛋白重链表达。他们结合血脂，而不是肽。虽然它们的结构确认的CD1蛋白MHC I类和II类抗原呈现分子的相似性，mCD1d槽比较窄，深，高疏水性和它有两项具有约束力的口袋，而不是为经典所描述的几个浅口袋MHC编码的抗原提呈分子。根据其氨基酸序列，这样一个hydrobphobic槽提供了一个理想的环境脂质抗原结合。

自然杀伤T（NKT）细胞使用他们的TCR识别势必会或CD1d糖脂。已参与对保护自身免疫性疾病和传染病和肿瘤排斥反应的T细胞CD1所提出的血脂。因此，辨别能力，净化，并跟踪CD1反应NKT细胞的反应是非常重要的。 α-半乳糖神经酰胺（A - Galcer）与CD1d四聚体的生成NKT细胞生物学的重要见解。从其他CD1的分子构造的四聚体也已产生，这些新的试剂，极大地扩大了监测脂质为基础的疫苗的反应的潜在使用，并在自身免疫性疾病和其他的诊断的脂质反应性T细胞的功能的知识，治疗。

研究方案

一，解冻的细胞

TN5细胞的冷冻瓶，并在37℃水浴解冻。 25厘米²训练班烧瓶中加入5毫升昆虫快递培养基（Invitrogen公司的产品目录号10486）。注意表达五年没有谷氨酰胺;需要添加100X谷氨酰胺笔链球菌单独或谷氨酰胺1 LT媒体10毫升。添加到TN5细胞，并在29 ° C培养箱中孵育30分钟。然后，吸用DMSO中轻轻互不干扰烧瓶底部的细胞。添加新鲜培养基5毫升。

二。成长壮大的细胞

监控细胞的每一天。当烧瓶中近70％融合，敲打两边的容量瓶中，使悬浮液中的细胞和转移细胞175厘米²烧瓶中加入21毫升昆虫表达介质和细胞培养5毫升。每个T175烧瓶中应该有大约25 - 30ML作为最终体积中等。拆分融合瓶（约1万个/毫升浓度）1 / 4或1 / 5需要。不要让细胞过度生长。计数的一些段落，你有分裂细胞。不要增长，通过30号，因为它可能会导致老化的细胞产生的细胞裂解。当您达到所需的量，在1万/毫升的浓度感染的细胞。

我一般长大到2至2.5升，通常达七十175厘米约²瓶和。 25日至30毫升/容量瓶中，5个1公升的锥形瓶，约。在每个烧瓶400毫升至500毫升

注意：您既可以增加细胞中的T - 175插头密封瓶或康宁锥形瓶中。在锥形烧瓶中生长的细胞是更快，更容易。

三。滴定终点稀释法病毒

1. 板3000-5000平底快递五个SFM培养基200ul 96孔板，每孔细胞。让细胞在27℃，至少30分钟解决。
2. 杆状病毒股票连续稀释。人应该这样做一行96 ü底板的1 / 10稀释，每孔250ul。快运五SFM培养基稀释。
3. 使用多道移液器，转让的不同稀释度的固定金额（通常为20 UL）的细胞。
4. 文化在27 ° C为7天。为了避免从边缘行的蒸发，包装封口膜板边缘。
5. 经过7天中，检查的板块，并确定给出了50％的感染病毒稀释 - 感染这种病毒的浓度的一半井）。然后使用一个公式来计算的滴度，这是PFU / ml的（PFU斑形成单位）表示。其计算公式为最杆状病毒手册。

四。感染的细胞

知道确切的病毒滴度，这是非常重要。添加所需的病毒数量。对于病毒备料的细胞被感染的多重感染（MOI），不超过1（1pfu 1High五单元）提高惯性导致病毒突变的生产。对于蛋白质的生产，通常金额MO1 5-10。

例如：

mCD1d杆状病毒滴度= 1X108 PFU / ml的

新增教学语言= 1（放大病毒）= 20 × 10 ^ 6细胞/烧瓶/ 1X10 ^ 8 PFU / ml的= 200 UL /烧瓶

MOI = 5至10（蛋白生产）= 1ml到2毫升对于20 × 10 ^ 6细胞/烧瓶

感染后第4天，在受感染的细胞。他们应该分离，漂浮，肿胀，形成香肠。

五，恢复上清液

从感染的烧瓶中，并转移到250毫升蓝帽猎鹰纺纱瓶。他们可高压灭菌和重用。均匀填充瓶子，并在Sorvall GSA转子离心细胞200rpm，20分钟后，4 ° C收集上清液，并进行进一步纯化。

六。纯化重组mCD1d

1. 透析和150mm的磷酸钠缓冲液的浓度（pH值7.4）
2. 经Ni - NTA琼脂糖层析，洗脱蛋白mCD1d + B2M与150mm的钠磷酸盐200毫米Immidazole
3. 使用20mm的三盐酸PH8缓冲区Immidazole摆脱运行脱盐柱
4. 运行使用阴离子交换层析MonoQ列，以消除剩余的污染物。
5. 集中1mg/ml的使用YM 30选矿厂（Millipore公司）
   
6. 比拉酶biotynlation的mCD1d根据制造商的协议（亲和力）
   
7. S200列，用磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.4的（体积排阻Chromatograpy）免费素被淘汰。平均2至3 biotynlated蛋白质MGS可以得到2升上清
8. A - Galcer CD1d四聚体的生产。

为了加载一个Galcer CD1d分子，可溶性biotynlated CD1d - B2M是3倍摩尔A - Galcer超过0.5％吐温-20的PBS，O.9％氯化钠溶解，室温孵育过夜。四聚体的生成混合A - Galcer加载CD1d单体在室温为4小时4倍摩尔超过PE - 共轭链霉亲和孵化。储存在48 ° C。

讨论

在此过程中，它是如何启动，成长，感染昆虫细胞，以及如何滴度使用这些细胞的杆状病毒。在此过程中最重要的方面是细胞的维护和知道确切的杆状病毒滴度。一旦你已经产生了CD1的四聚体，它们可以被用来作为糖脂反应性T细胞的功能强大的分析工具。杆状病毒系统也广泛用于生产重组蛋白，包括MHC II类四聚体，所以此过程有一个更广泛的适用性。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Express Five SFM	Serum Free Medium	Invitrogen	10486025
High Five TM	Insect Cells	Invitrogen	B855-02
Glutamine Pen strep	Antibiotics	Invitrogen	10378-016
25cm2 TC Flask	Plastic	Fisher Scientific	10-126-28
175 cm2 TC Flask	Plug seal flask	Fisher Scientific	10-126-8
Erlenmeyer Flask	Cell Culture Flask	Fisher Scientific	07 200 672
YM 30 Concenterator	30,000 MWCO	EMD Millipore	UFC 903096
FPLC equipment		GE Healthcare
BrA Enzyme and Buffer	Biotinylation Kit	Avidity	BIRA500
Ni-NTA Agarose Column	His Tag Protein Purification Column	GE Healthcare
Desalting column	To get Rod of Salt from Protein	GE Healthcare
MonoQ Column	Anion Exchange Chromatgraphy	GE Healthcare
S200 Column	Size Exclusion Chromatography	GE Healthcare
alpha-Galcer	Glycolipid
PE- Streptavidin	For conjugating Protein	Molecular Probes, Life Technologies	S-866