곤충 세포에서 재조합 단백질의 생산 mCD1d하는 방법.

요약

곤충 세포를 준비하고 mCD1d tetramers를 생성하는 재조합 mCD1d의 proteinand의 생산의 목적으로 baculovirus으로 그들을 감염하는 방법.

초록

CD1 단백질은 항원 제시 분자의 세 번째 클래스를 구성합니다. 그들은 noncovalently beta2 - microglobulin과 관련된 약 50 KDA glycosylated 무거운 사슬로 표현 세포 표면 glycoproteins입니다. 그들은 lipids보다는 펩티드를 바인딩합니다. 그들의 구조가 MHC 클래스 I 및 클래스 II의 항원 제시 분자로 CD1 단백질의 유사성을 확인했지만, mCD1d 홈은 비교적 좁은 깊이, 그리고 높은 소수성이며, 그것은 고전에 대한 설명 여러 얕은 주머니 대신에 두개의 바인딩 주머니를 가지고 MHC - 항원 제시 분자를 인코딩. 자신의 아미노산 시퀀스에 따라, 그러한 hydrobphobic 홈은 지질 항원의 바인딩을위한 이상적인 환경을 제공합니다.

자연 킬러 T (NKT) 세포는 바운드 또는 CD1d에 의해 제시 glycolipids을 인식하기 위해 TCR을 사용합니다. CD1 제시한 lipids에 반응 T 세포는 면역과 전염병에 대한 보호 및 종양 제거에 참여하고 있습니다. 따라서, 식별 정화하고, CD1 - 반응 NKT 세포의 반응을 추적하는 능력은 매우 중요합니다. CD1d와 알파 Galactosyl ceramide (A - Galcer)의 tetramers의 세대는 NKT 세포의 생물학에 상당한 통찰력을하고 있습니다. 다른 CD1 분자로부터 만들어진 Tetramers도 생성되었으며 이러한 새로운 시약이 크게 지질 기반 백신에 대한 반응을 모니터링 잠재적인 사용과 면역 질병 및 기타의 진단에 지질 반응 T 세포의 기능의 지식을 확대 트리 트먼트.

프로토콜

마찬가지 세포를 해동

TN5 세포의 냉동 약병을 가지고, 37 ° C의 물을 욕조에 녹여. 25cm ² TC 플라스크에 곤충 익스프레스 매체 5ml (Invitrogen, 카탈로그 번호 - 10486)를 추가합니다. 익스프레스 주민 글루타민없이 오는 것을 참고, 100X 글루타민 펜 strep 또는 1 다 미디어에 혼자 글루타민의 10ml를 추가해야합니다. 그것에 TN5 세포를 추가하고 27 ° C 배양기에서 30 분 알을 품다. 그런 다음, 플라스크의 바닥에 부착된 세포를 방해하지 않고 부드럽게 DMSO와 매체를 대기음. 신선한 매체의 5ml를 추가합니다.

II. 성장과 세포 확장

매일 세포를 모니터링합니다. 플라스크 거의 70% 합류하면, 양쪽에있는 술병을 닌가하여 정지 전지를 가져와 및 곤충 표현 매체 및 세포 배양의 5ml 21 ML 추가하여 175cm ² 플라스크에 세포를 전송합니다. 각 T175 플라스크은 최종 볼륨으로 25 - 30ml 중간 주변 있어야합니다. 합류 플라스크 (약 1,000,000 / ML CONC.) 필요에 따라 4분의 1 또는 5분의 1. 스플릿 세포의 자라다을하게하지 마십시오. 당신이 세포를 분리한다는 구절의 개수를 계산합니다. 그것이 세포 용해를 발생 세포의 노화가 발생할 수 있기 때문에 통로 번호 30여 성장하지 마십시오. 당신은 1,000,000 / ML의 농도에서 원하는 볼륨에 도달하면, 세포를 감염.

나는 일반적으로 보통 일흔 175cm ² flasks 약에 금액 2-2.5 리터까지 성장. 25 / 30ml 플라스크, 5 1리터의 Erlenmeyer flasks의 약 수 있습니다. 각 플라스크에 400ml 500 ML

참고 : 하나 T - 175 플러그 인감 플라스크 또는 코닝 Erlenmeyer 플라스크에 세포를 성장하실 수 있습니다. Erlenmeyer Flasks의 성장 세포가 빠르고 쉽습니다.

III. 엔드 포인트 희석 방법으로 바이러스를 Titering

1. 익스프레스 오 SFM 매체의 200ul에 플랫 바텀 96 잘 판에 잘 따라 플레이트 3000-5000 세포. 세포가 27 ° C 이상에서 30 분 정착하자.
2. baculovirus 주식 일련 희석하십시오. 하나는 잘 당 250ul를 사용하여, 96 음 U 바닥 접시의 한 줄에 10분의 1 희석을해야합니다. Dilutions은 익스프레스 다섯 SFM 매체에 만들어집니다.
3. 멀티채널 피펫을 사용하여 세포를 다른 dilutions의 고정 금액 (보통 20 UL)을 전송합니다.
4. 27 7 일 동안 ° C에서 문화. 가장자리 행을의 증발을 방지하려면, parafilm와 접시의 가장자리를 바꿈.
5. 칠일 후에 접시를 확인하고 바이러스의 어떤 희석은 50 % 감염을 제공 결정 -이 바이러스 농도에서 절반 우물이 감염됩니다.) 다음 pfu / ML (pfu - 플라크 형성 단위)로 표시됩니다 titer를 계산하는 수식을 사용합니다. 수식이 가장 baculovirus 설명서에서 찾을 수 있습니다.

IV. 세포를 감염

그것은 바이러스의 정확한 titer를 알고 매우 중요합니다. 바이러스 요구하는 금액을 추가합니다. 바이러스성 재고 준비 전지가 아니라 더 높은 뫄 바이러스는 변이의 생산 리드 (1pfu은 다섯 셀 1High)를 1보다 감염의 다중성 (뫄)에 감염되어야합니다. 단백질 생산, 일반적인 금액은 MO1 50-10 있습니다.

예 :

mCD1d baculovirus의 titer = 1X108 pfu / ML

추가 뫄 = 1 (바이러스를 증폭하기 위해) = 20X10 ^ 6 세포 / 술병 / 1X10 ^ 8 pfu / ML = 200 UL / 술병

뫄 = 5-10 (단백질 생산을위한) 20x10 들어 = 1ml에 2ml ^ 6 세포 / 술병

감염 후 4 일, 감염된 세포보세요. 그들은, 부동, 부어 성형 소세지를 분리해야합니다.

V. 복구 Supernatants

감염된 flasks에서 매체를 가지고, 250ml 파란 모자 팰컨 스피닝 병을로 전송할 수 있습니다. 그들은 autoclaved하고 활용할 수 있습니다. 200rpm 20 분, 4 ° C.에 골고루 병을 기입하고 Sorvall GSA 로터의 세포를 원심 분리기 뜨는를 수집하고 더 정화를위한 진행합니다.

VI. 재조합 mCD1d의 정화

1. 150mM 인산 나트륨 버퍼에 투석과 농도 (산도 7.4)
2. 니켈 - NTA 아가로 오스 크로마 토그래피함으로써, 150mM 인산 나트륨 200 MM Immidazole와 단백질 mCD1d + b2m을 elute
3. Immidazole 없애 20mM 트리스 HCL pH8 버퍼를 사용하여 탈염 컬럼을 실행
4. 나머지 오염 물질을 제거 MonoQ 칼럼을 사용하여 음이온 교환 크로마 토그래피를 실행합니다.
5. YM 30 농축기 (Millipore)를 사용 1mg/ml에 집중
   
6. 의 비라 효소 biotynlation는 제조 업체의 프로토콜 (욕망)에 따라 mCD1d
   
7. 무료 비오틴은 식염수 (PBS), pH7.4를 버퍼 인산염을 사용 S200 열 (사이즈 제외 Chromatograpy)에 의해 제거됩니다. biotynlated 단백질 2 ~ 3 MGS의 평균 뜨는의 2리터에서 구할 수
8. - Galcer CD1d tetramer 생산.

A - Galcer과 가용성 biotynlated CD1d - B2를 CD1d 분자를로드하기 위해서는m은 PBS에 0.​​5 % 트윈 -20, O.9 %의 나트륨 염화물에 녹아있는 한 Galcer 세 배 이상 초과 어금니와 실온에서 하룻밤 incubated입니다. 복합 streptavidin과 실온에서 4 시간 동안 잠복기 - Tetramers는 PE의 4 배 초과 어금니와 - Galcer 로드된 CD1d 단량체의 혼합에 의해 생성됩니다. 48시 스토어 ° C.

토론

이 절차에서는, 그것은, 시작 성장, 곤충 세포를 감염하고 이러한 세포를 사용하여 baculovirus를 titer하는 방법을하는 방법을 보여줍니다. 이 절차의 가장 중요한 측면은 세포의 유지 보수하고 baculovirus의 정확한 titer를 알고. 일단 CD1 tetramers를 생성, 그들은 glycolipid 반응 T 세포 분석을위한 강력한 도구로 사용할 수 있습니다. Baculovirus 시스템은 또한 MHC 클래스 II의 tetramers 때문에이 절차는 훨씬 광범위한 응용을 포?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Express Five SFM	Serum Free Medium	Invitrogen	10486025
High Five TM	Insect Cells	Invitrogen	B855-02
Glutamine Pen strep	Antibiotics	Invitrogen	10378-016
25cm2 TC Flask	Plastic	Fisher Scientific	10-126-28
175 cm2 TC Flask	Plug seal flask	Fisher Scientific	10-126-8
Erlenmeyer Flask	Cell Culture Flask	Fisher Scientific	07 200 672
YM 30 Concenterator	30,000 MWCO	EMD Millipore	UFC 903096
FPLC equipment		GE Healthcare
BrA Enzyme and Buffer	Biotinylation Kit	Avidity	BIRA500
Ni-NTA Agarose Column	His Tag Protein Purification Column	GE Healthcare
Desalting column	To get Rod of Salt from Protein	GE Healthcare
MonoQ Column	Anion Exchange Chromatgraphy	GE Healthcare
S200 Column	Size Exclusion Chromatography	GE Healthcare
alpha-Galcer	Glycolipid
PE- Streptavidin	For conjugating Protein	Molecular Probes, Life Technologies	S-866