一种直接从一滴血液中快速中性粒细胞趋化分析的片上方法

摘要

本文提供了通过在单个微流体芯片上整合来自全血的片上嗜中性粒细胞分离和趋化性测试来进行快速嗜中性粒细胞趋化性测定的详细方法。

摘要

嗜中性粒细胞迁移和趋化性对我们身体的免疫系统至关重要。微流控装置越来越多地用于调查嗜中性粒细胞迁移和趋化性，因为它们具有实时可视化，精确控制化学浓度梯度产生以及降低的试剂和样品消耗的优点。最近，微流体研究人员正在越来越多地努力开发直接从全血中开发整合且易于操作的微流体趋化性分析系统。在这个方向上，第一个全芯片方法被开发用于整合嗜中性粒细胞的磁性负性纯化和来自小血容量样品的趋化性测定。这种新方法允许在25分钟内快速进行样品至结果嗜中性粒细胞趋化性测试。在本文中，我们提供了详细的构建，操作和数据分析方法，用于片上趋化性测定，讨论故障排除策略，limi重点和未来发展方向。显示了使用这种全芯片方法测试定义的化学引诱物， N-甲基-Mult-Leu-Phe（fMLP）和来自慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的痰的中性粒细胞趋化性测定的代表性结果。该方法适用于许多细胞迁移相关调查和临床应用。

引言

趋化因子是一种有针对性的细胞迁移到可溶性化学物质浓度梯度的过程，在很多生物学过程中都是非常重要的，包括免疫反应^1,2,3 ，组织发育⁴和癌症转移⁵ 。嗜中性粒细胞是最丰富的白细胞亚群，在使身体的先天宿主防御功能以及介导适应性免疫反应^6,7中发挥关键作用。嗜中性粒细胞配备有高度调节的趋化机制，允许这些运动免疫细胞通过化学疗法8对病原体衍生的化学引诱物（ 例如 fMLP）和宿主衍生的化学引诱物（ 例如白细胞介素-8）作出反应。嗜中性粒细胞迁移和趋化性介导各种生理问题和疾病如炎症和癌症^1,9 。因此，准确评估嗜中性粒细胞趋化性为研究嗜中性粒细胞生物学和相关疾病提供了重要的功能读数。

与广泛使用的常规趋化性测定（ 例如 transwell测定¹⁰ ）相比，由于精确控制的化学梯度产生和小型化^，微流控装置显示出对定量评估细胞迁移和趋化性的巨大前景^11,12,13 。在过去二十年左右，已经开发出各种微流体装置来研究不同生物细胞类型，特别是中性粒细胞^1....

研究方案

所有人类样品采集方案均由温尼伯曼尼托巴大学联合学院研究伦理委员会批准。

微流体装置制造（ 图1A ）

1. 设计和打印透明面具。
   1. 设计设备如前所述²⁵ 。参见图1A 。
      注意：设备包括两层。第一层（4μm高）限定了细胞对接屏障通道，以将细胞捕获在梯度通道旁边。第二层（60μm高）定义了梯度产生通道，电池负载的端口和通道，化学品入口容器和废物出口。对准标记设计用于两层。对于第二层，上游蛇形输入通道的长度和宽度分别为60mm和200μm;下游的长度和宽度蛇形输入通道分别为6 mm和280μm。
   2. 使用高分辨率打印机将第一和第二层功能打印到透明蒙版。
      注意：打印分辨率取决于设计中的最小功能。在目前的设计中，选择了32,000 dpi，最小为10μm。
2. 清洁硅片。
   1. 将硅片放入等离子体清洁机中。施加真空3分钟。
   2. 打开等离子电源并将电平设置为高电平。使用氧等离子体处理硅晶片30分钟。
   3. 关闭等离子体清洁器并取出硅片;硅晶片准备用于制造器件模具。

结果

嗜中性粒细胞直接在微流体装置中从一滴全血中选择。通过片上吉姆萨染色验证了分离的嗜中性粒细胞的纯度，结果显示中性粒细胞典型的环状和叶状核（ 图2A ） ²⁵ 。这表明从小体积的全血中可以获得高纯度的片上嗜中性粒细胞分离。此外，对接结构可以在施加化学梯度（ 图2B ） ²⁵之前有?.......

讨论

在本文中，描述了在单个微流体芯片上直接从全血中分离嗜中性粒细胞并进行趋化性试验的详细方案。该方法易于操作，阴性选择高纯度中性粒细胞，快速样品至结果趋化性测试，减少试剂和样品消耗，以及精确的细胞迁移数据分析，提供了有用的功能。粗略估计，来自输入全血样本的嗜中性粒细胞的至少25％有效地进入装置中的对接结构，并且通过片上吉姆萨染色发现嗜中性粒细胞纯度高。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device fabrication
Mask aligner	ABM	N/A
Spinner	Solitec	5000
Hotplate	VWR	11301-022
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Vacuum dessicator	Fisher Scientific	08-594-15A
Digital scale	Ohaus	CS200
SU-8 2000 thinner	Microchem	SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist	Microchem	SU-8 2025
SU-8 developer	Microchem	SU-8 developer
Si wafer	Silicon, Inc	LG2065
isopropyl alcohol	Fisher Scientific	A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane	Gelest	78560-45-9
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	2065622
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Glass slides	Fisher Scientific	12-544-4
Cutting pad	N/A	N/A	Custom-made
Punchers	N/A	N/A	Custom-made
Name	Source	Catalog Number	Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640	Fisher Scientific	SH3025502
DPBS	Fisher Scientific	SH3002802
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	SH3057402
Fibronectin	VWR	CACB356008
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
Magnetic disks	Indigo Instruments	44202-1	5 mm in diameter, 1 mm thick
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD10S
Rhodamine	Sigma-Aldrich	R4127-5G
Giemsa stain solution	Rowley Biochemical Inc.	G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	STEMCELL Technologies Inc	19666
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope	Nikon	Ti-U
Microscope environmental chamber.	InVivo Scientific	N/A
CCD camera	Nikon	DS-Fi1