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  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Cet article fournit la méthode détaillée pour effectuer un dosage rapide de la chimiotaxie des neutrophiles en intégrant l'isolement des neutrophiles sur le puits du sang total et le test de la chimiotaxis sur une seule puce microfluidique.

Résumé

La migration des neutrophiles et la chimiotaxie sont essentielles pour le système immunitaire de notre corps. Les dispositifs microfluidiques sont de plus en plus utilisés pour étudier la migration des neutrophiles et la chimiotaxie en raison de leurs avantages dans la visualisation en temps réel, un contrôle précis de la génération de gradient de la concentration chimique et une réduction de la consommation de réactifs et d'échantillons. Récemment, les chercheurs en microfluidique ont fait de plus en plus d'efforts pour développer des systèmes d'analyse de chimiotaxie microfluidiques intégrés et facilement exploités, directement à partir de sang total. Dans cette direction, la première méthode tout-sur-puce a été développée pour intégrer la purification négative magnétique des neutrophiles et l'analyse chimiotaxique à partir de petits échantillons de volume sanguin. Cette nouvelle méthode permet un test de chimiotaxie neutrophile rapide à l'échantillon à 25 minutes. Dans cet article, nous fournissons une méthode détaillée de construction, d'exploitation et d'analyse de données pour ce test de chimiotaxie tout-sur-puce avec une discussion sur les stratégies de dépannage, limiTations et directions futures. Les résultats représentatifs du test de chimiotaxie des neutrophiles d'un test chimiochimique défini, du N -Formométhyl-Met-Leu-Phe (fMLP) et des expectorations d'un patient souffrant d'une maladie pulmonaire obstructive chronique (COPD), en utilisant cette méthode tout-sur-puce sont présentés. Cette méthode s'applique à de nombreuses recherches liées à la migration cellulaire et aux applications cliniques.

Introduction

La chimiotaxie, un processus de migration cellulaire dirigée vers un gradient de concentration chimique soluble, est implicitement impliqué dans de nombreux processus biologiques, y compris la réponse immunitaire 1 , 2 , 3 , le développement tissulaire 4 et la métastase du cancer 5 . Les neutrophiles sont le sous-ensemble de globules blancs les plus abondants et jouent un rôle crucial en permettant les fonctions de défense de l'hôte inné du corps, ainsi que dans la médiation des réponses immunitaires adaptatives 6 , 7 . Les neutrophiles sont équipés de machines chimiotactiques hautement réglementées permettant à ces cellules immunitaires mobiles de répondre à la fois aux chimioattractants dérivés des agents pathogènes ( p. Ex . FMLP) et aux chimioattractants dérivés de l'hôte ( p . Ex . Interleukine-8) par voie de chocostat 8 . La migration des neutrophiles et la chimiotaxie mènent divers problèmes physiologiquesEt des maladies telles que l'inflammation et les cancers 1 , 9 . Ainsi, l'évaluation précise de la chimiotaxie des neutrophiles fournit une lecture fonctionnelle importante pour l'étude de la biologie des neutrophiles et des maladies associées.

Par rapport aux tests de chimiotaxis classiques largement utilisés ( p. Ex. Essai de transwell 10 ), les dispositifs microfluidiques sont très prometteurs pour une évaluation quantitative de la migration cellulaire et de la chimiotaxie en raison de la génération et de la miniaturisation des gradients chimiques 11 , 12 , 13 . Au cours des deux dernières décennies, divers dispositifs microfluidiques ont été développés pour étudier la chimiotaxie de différents types de cellules biologiques, en particulier les neutrophiles 11 . Des efforts considérables ont été déployés pour caractériser la migration des neutrophiles dans les complexes spatiotemportaux complexes Gradients miques qui ont été configurés dans les dispositifs microfluidiques 14 , 15 . Des stratégies intéressantes ont également été développées pour étudier la prise de décision directionnelle par les neutrophiles à l'aide des dispositifs microfluidiques 16. À l' aide d'une recherche biologiquement orientée, les applications des dispositifs microfluidiques ont été étendues pour tester les échantillons cliniques pour l'évaluation de la maladie 17 , 18 , 19 . Cependant, l'utilisation de nombreux dispositifs microfluidiques est limitée aux laboratoires de recherche spécialisés et nécessite une longue isolation des neutrophiles à partir d'un grand volume d'échantillons de sang. Par conséquent, il existe une tendance croissante à développer des dispositifs microfluidiques intégrés pour une analyse rapide de la chimiotaxie des neutrophiles directement à partir d'une goutte de sang total 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

Dans cette direction, une méthode all-on-chip a été développée qui intègre la purification neutrophile négative magnétique et le dosage de chimiotaxie subséquent sur un seul dispositif microfluidique 25 . Cette méthode tout-à-puce présente les nouvelles fonctionnalités suivantes: 1) contrairement aux stratégies antérieures sur la puce qui isolent les neutrophiles du sang par la capture cellulaire à base d'adhésion ou le filtrage basé sur la taille des cellules 20 , 22 , cette nouvelle méthode permet une augmentation La pureté, la séparation magnétique des neutrophiles sur les puce à partir de petits volumes de sang total, ainsi que la mesure de la chimiotaxis lors de la stimulation chimioattractive; 2) la structure d'ancrage de la cellule aide à aligner les positions initiales des neutrophiles près du canal de gradient chimique et permet une analyse chimiotaxique simple sans suivi de cellule unique; 3) l'intégration de l'isolement et du chimotine des neutrophilesL'analyse des axes sur un seul dispositif microfluidique permet une analyse chimio-chimiométrique rapide d'échantillon à résultat en 25 minutes lorsqu'il n'y a pas d'interruption entre les étapes expérimentales.

Cet article fournit un protocole détaillé pour la méthode de construction, d'exploitation et d'analyse de données de ce test de chimiotaxis tout-sur-puce. Le document démontre l'utilisation efficace de la méthode développée pour la réalisation de la chimiotaxie des neutrophiles en testant des échantillons chimiotactiques recombinants et chimiotactiques recombinés connus, suivis d'une discussion sur les stratégies de dépannage, les limites et les orientations futures.

Protocole

Tous les protocoles de collecte d'échantillons humains ont été approuvés par le Joint-Faculty Research Ethics Board de l'Université du Manitoba à Winnipeg.

1. Fabrication de dispositifs microfluidiques ( figure 1A )

  1. Conception et impression de masque de transparence.
    1. Concevez l'appareil comme décrit précédemment 25 . Voir la figure 1A .
      REMARQUE: l'appareil comprend deux couches. La première couche (4 μm de hauteur) définit le canal de la barrière d'ancrage de la cellule pour piéger les cellules à côté du canal dégradé. La deuxième couche (60 μm de hauteur) définit le canal de génération de gradient, le port et le canal pour le chargement des cellules, les réservoirs d'entrée chimiques et la sortie des déchets. Les marques d'alignement sont conçues pour les deux couches. Pour la deuxième couche, la longueur et la largeur du canal d'entrée en serpentin en amont sont respectivement de 60 mm et 200 μm; La longueur et l'épaisseur de l'avalLe canal d'entrée en serpentin est respectivement de 6 mm et 280 μm.
    2. Imprimez les caractéristiques de la première et de la deuxième couche dans un masque de transparence à l'aide d'une imprimante haute résolution.
      REMARQUE: la résolution d'impression dépend des caractéristiques minimales de la conception. Dans la conception actuelle, 32 000 ppp ont été choisis pour une caractéristique minimale de 10 μm.
  2. Nettoyez la plaquette de silicium.
    1. Placez une plaquette de silicium de 3 po dans le nettoyeur à plasma. Appliquer l'aspirateur pendant 3 min.
    2. Activez la puissance du plasma et réglez le niveau sur HIGH. Utilisez le plasma d'oxygène pour traiter la plaquette de silicium pendant 30 minutes.
    3. Éteignez le nettoyeur de plasma et sortez la plaquette de silicium; La plaquette de silicium est prête à fabriquer le moule de l'appareil.
  3. Fabriquer la première couche par photolithographie dans une salle blanche.
    REMARQUE: les paramètres de fabrication exacts peuvent varier en fonction de l'installation de fabrication.
    1. Diluer 10 mL de SU-8 2025 avec 10 mL de SU-8 2000 dans un briseur de verre pour préparer le photorésist conçu. Laissez le mélange dans la hotte pendant 10 minutes jusqu'à ce que les bulles disparaissent.
    2. Placez soigneusement la pastille de silicium nettoyée sur la centrifugeuse avec le mandrin approprié et appliquez le vide pour immobiliser la plaquette de silicium.
    3. Verser soigneusement 3 ml du mélange de photoresist sur le centre de la plaquette de silicium. Tourner à 500 tr / min pendant 5 s. Ensuite, tournez à 3 000 tr / min pendant 30 s pour obtenir un revêtement de résine photosensible final de 4 μm sur la plaquette de silicium.
    4. Retirez soigneusement la plaquette de silicium de la centrifugeuse et faites cuire la plaquette de silicium sur une plaque chauffante pendant 4 min à 95 ° C.
    5. Placez soigneusement la plaquette de silicium sur un alignement de masque et réglez le temps d'exposition aux UV à 6 s. Fixez soigneusement le masque de transparence de la première couche sur une plaque de verre transparente à l'aide d'un ruban adhésif.
    6. Placez doucement la plaque de verre transparente avec le masque attaché à l'alignement et alignez le masque avec la plaquette de silicium. Exposez le siLicon wafer à l'UV pour modeler la structure d'amarrage de la cellule.
    7. Retirez délicatement la plaque de verre et enlevez la plaquette de silicium exposée. Faire cuire la plaquette de silicium sur une plaque chauffante pendant 4 min à 95 ° C.
    8. Transférez la plaquette de silicium à une hotte et placez-la dans un récipient en verre contenant le développeur SU-8. Secouez doucement pendant 30 s.
    9. Nettoyez la plaquette de silicium en utilisant un nouveau développeur SU-8 suivi d'un alcool isopropylique (IPA) à l'intérieur de la hotte aspirante. Sécher la plaquette de silicium par du gaz d'azote à l'intérieur de la hotte aspirante; La première couche est prête.
  4. Créez la deuxième couche sur la première couche.
    1. Utilisez un ruban adhésif pour couvrir les marques d'alignement sur la première couche. Placez soigneusement la pastille de silicium avec la première couche sur le mandrin sous vide de la centrifugeuse et appliquez un vide pour immobiliser la tranche de silicium.
    2. Verser 3 mL de photoréserve SU-8 2025 sur la plaquette de silicium. Faire tourner la plaquette de silicium à 500 tr / min pendant 5 s. Ensuite, tournez à 2000 tr / min pour 30S pour obtenir un revêtement final de photoresist de 60 μm d'épaisseur sur la plaquette de silicium.
    3. Retirez soigneusement la plaquette de silicium de la centrifugeuse et transférez-la sur une plaque chauffante; Cuire à 65 ° C pendant 2 min.
    4. Retirez doucement le ruban adhésif pour exposer les repères d'alignement sur la première couche. Placez la plaquette de silicium sur une plaque chauffante et faites cuire à 95 ° C pendant 6 min.
    5. Placez soigneusement la plaquette de silicium sur un alignement de masque et réglez le temps d'exposition aux UV à 18 s.
    6. Fixez soigneusement le masque de transparence de la deuxième couche sur une plaque de verre transparente à l'aide d'un ruban adhésif.
    7. Placez soigneusement la plaque de verre avec le masque attaché à l'alignement et alignez le masque et la première couche sur la plaquette de silicium par les marques d'alignement de croisement à l'aide du microscope d'inspection de l'alignement.
    8. Exposez la plaquette de silicium revêtue de photorésist aux rayons ultraviolets pour modéliser les canaux de chargement et de gradient des cellules.
    9. Retirez délicatement la plaque de verre et sortez le silicium wAfer. Faire cuire la plaquette de silicium sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 2 min, puis transférer la plaquette de silicium dans une autre plaque chauffante à 95 ° C et cuire au four pendant 6 min.
    10. Transférez la plaquette de silicium à la hotte et placez-la dans un récipient en verre contenant le développeur SU-8. Secouez doucement pendant 6 minutes.
    11. Nettoyez la plaquette de silicium en utilisant un nouveau développeur SU-8 suivi d'un IPA à l'intérieur de la hotte aspirante.
    12. Sécher la plaquette de silicium à l'aide de gaz d'azote à l'intérieur de la hotte aspirante. Placez la plaquette de silicium sur une plaque chauffante et durci le moule à 150 ° C pendant 30 minutes; La deuxième couche est prête.
  5. Maîtrise de la modification de la surface du moule.
    NOTE: Une étape de modification de la surface de silanisation est appliquée au moule SU-8 pour faciliter la libération du polydiméthylsiloxane (PDMS) à partir du moule dans la lithographie douce.
    1. Prendre 10 μL de solution de tridecafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyle (trichlorosilane) dans une pointe de micropipette. Mettez la pointe de la micropipette dans un tube en plastique de 15 mL aEt desserrer le capuchon du tube.
    2. Placez le tube et la tranche de silicium à motif SU-8 à l'intérieur d'un déshydratant et appliquez le vide pendant 1 h; Le masque est prêt à fabriquer le dispositif PDMS.
  6. Fabrirez le périphérique PDMS.
    1. Préparez la solution PDMS en mélangeant 40 g de base PDMS et 4 g d'agent de durcissement dans un bécher en plastique. Placez le moule maître SU-8 préparé dans une boîte de Petri et versez soigneusement une solution PDMS de 44 g sur le moule.
    2. Placer la boîte de Petri dans un dessicateur et appliquer un vide pour dégager la solution PDMS pendant 20 min. Ensuite, placez la boîte de Petri dans un four et curez le PDMS à 80 ° C pendant 2 h.
    3. Après la cuisson, sortez la boîte de Petri et placez-la sur un banc propre. Couper avec précaution et éplucher la dalle PDMS du moule SU-8.
    4. Sortez le port de chargement de la cellule à l'aide d'un perforateur de 3 mm de diamètre. Sortez les réservoirs d'entrée chimiques et la sortie des déchets en utilisant un perforateur de diamètre de 6 mm.
    5. Retirer la poussière sur leSurface de la dalle PDMS à l'aide d'un ruban adhésif. Placez la dalle PDMS et une glissière de verre propre dans la machine à plasma. Appliquer l'aspirateur pendant 3 min.
    6. Activez la puissance du plasma et réglez le niveau sur HIGH. Réglez doucement la soupape d'air et plasmassez la dalle PDMS et la glissière de verre pendant 3 min.
    7. Éteignez la puissance du plasma et relâchez le vide. Retirez délicatement la dalle PDMS et la glissière en verre à l'aide d'une pince à épiler.
    8. Placez immédiatement la dalle PDMS (avec des structures de canal face vers le bas) au dessus de la glissière en verre; Appuyez doucement sur la dalle PDMS pour la lier au verre. Remplir immédiatement le canal microfluidique avec de l'eau désionisée; La fabrication et l'assemblage du dispositif microfluidique sont terminés.

2. Préparation du dosage de la migration des cellules microfluidiques

  1. Préparation du dispositif microfluidique.
    1. Préparez une solution de fibronectine à 50 μg / mL en diluant 50 μL de solution de fibronectine stock (1 mg / mL) à 95081; la solution saline tamponnée au phosphate de L Dulbecco (DPBS) dans un cabinet de sécurité biologique.
    2. Préparez le milieu de migration en mélangeant 9 mL de milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) et 1 mL de RPMI-1640 avec 4% d'albumine de sérum bovin (BSA).
    3. Retirez l'eau désionisée de l'appareil.
    4. Ajouter 100 μL de solution de fibronectine à l'appareil à partir de la sortie. Attendez 3 min pour s'assurer que tous les canaux sont remplis de solution de fibronectine. Placez le dispositif microfluidique dans une boîte de Petri couverte pendant 1 h à température ambiante.
    5. Retirez la solution de fibronectine de l'appareil. Ajouter un milieu de migration de 100 μL à partir de la sortie. Attendez 3 minutes pour vous assurer que tous les canaux sont remplis avec un support de migration.
    6. Incuber l'appareil pendant encore 1 h à température ambiante; L'appareil est alors prêt pour l'expérience chimiotaxique.
  2. Préparation de la solution chimio-tractante pour l'expérience chimiotaxique.
    1. Préparer 100 nM solution fMLP dans t1 mL de milieu de migration. Mélanger 5 μL de FITC-Dextran stock (10 kDa, 1 mM) avec la solution de fMLP dans un tube de 1,5 mL.
      REMARQUE: FITC-Dextran est utilisé pour la mesure des dégradés. Alternativement, utilisez Rhodamine comme indicateur de gradient. La solution de chimioattracteur fMLP est alors prête pour une expérience chimiotaxique.
  3. Préparation de l'échantillon de crachat.
    NOTE: La chimiotaxie des neutrophiles induite par un gradient d'échantillon d'expectoration de patients atteints de MPOC a été testée comme une application de diagnostic clinique de cette méthode tout-sur-puce.
    1. Obtenir un protocole d'éthique humaine pour recueillir des échantillons de crachats provenant de patients atteints de MPOC.
      NOTE: Nous avons obtenu des approbations pour recueillir des échantillons à l'hôpital général Seven Oaks à Winnipeg (approuvé par l'Université du Manitoba).
    2. Obtenez les formulaires de consentement écrit en connaissance de cause de toutes les matières.
    3. Recueillir des échantillons spontanés d'expectorations des patients atteints de MPOC. Placer 500 μL d'échantillon d'expectoration dans un tube de 1,5 mL.
    4. Ajouter 500 μL 0,1% diThiothréitol dans le tube de 1,5 ml et mélanger doucement. Placer le tube dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min.
    5. Centrifuger l'échantillon à 753 xg pendant 10 min puis collecter le surnageant. Centrifuger le surnageant à 865 xg pendant 5 min, puis collecter le surnageant final. Stocker le surnageant collecté à l'intérieur d'un congélateur de -80 ° C avant utilisation.
    6. Lorsqu'il est prêt pour une expérience chimiotaxique, décongeler la solution d'expectoration; Transférer un milieu de migration de 900 μL à un tube de 1,5 mL et mélanger avec 100 μL de solution d'expectoration à l'intérieur d'un coffret de sécurité biologique; La solution d'expectoration est alors prête à l'expérience chimiotaxique.
  4. Collecte d'échantillon de sang.
    1. Obtenir un protocole d'éthique humain pour collecter des échantillons de sang provenant de donneurs sains. Obtenir les formulaires de consentement écrit en connaissance de cause de tous les donneurs de sang.
      NOTE: Des échantillons ont été obtenus à l'Hôpital général de Victoria à Winnipeg (approuvé par le Joint-Faculty Research Ethics Board de l'Université de ManitOba).
    2. Recueillir l'échantillon de sang par ponction veineuse et mettre l'échantillon dans un tube revêtu d'EDTA. Gardez le tube dans un coffret de sécurité biologique avant l'expérience.

3. Opération All-on-chip Chemotaxis Assay

  1. Isolation cellulaire sur puce ( Figure 1B ).
    1. Placer 10 μL de sang entier dans un tube de 1,5 mL dans un cabinet de sécurité biologique.
      NOTE: Les détails de la collecte des échantillons de sang se trouvent à la section 2.4.
    2. Ajouter 2 μL de cocktail d'anticorps (Ab) et 2 μL de particules magnétiques (MP) du kit d'isolation des neutrophiles (voir la table des matériaux) dans le tube de 1,5 ml et mélanger doucement; Cela étiquetera les cellules dans le sang, à l'exception des neutrophiles.
    3. Incuber le mélange sanguin-Ab-MP pendant 5 min à température ambiante.
      NOTE: Ceci marquera magnétiquement les cellules étiquetées par l'anticorps dans le sang.
    4. Fixez deux petits disques magnétiques sur les deux côtés du chargement de la cellule pOu de l'appareil. Aspirez le support de tous les ports de l'appareil.
    5. Pipeter lentement 2 μL de mélange sanguin-Ab-MP dans le dispositif microfluidique à partir du port de chargement de la cellule.
      REMARQUE: les cellules étiquetées magnétiquement sont piégées sur les parois latérales du port de chargement des cellules, tandis que les neutrophiles s'écoulent dans l'appareil et deviennent piégés dans la structure d'amarrage de la cellule.
    6. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que suffisamment de neutrophiles soient piégés dans la zone d'amarrage de la cellule.
  2. Dosage chimiotaxique ( figure 1C ).
    1. Placez le dispositif microfluidique sur le microscope à température contrôlée à 37 ° C.
    2. Ajouter 100 μL de solution chimioattractive (solution de fMLP ou d'expectoration) et 100 μL de milieu de migration à leurs réservoirs d'entrée désignés à l'aide de deux pipettes; Cela générera un gradient chimioattracteur dans le canal à gradient par un mélange chimique à base de flux laminaire continu assisté par une pressionE structure d'équilibrage.
      NOTE: Les détails de la collecte des expectorations chez les patients souffrant de MPOC figurent à la section 2.3.
      1. Pour l'expérience de contrôle moyen, n'ajoutez que le milieu de migration dans les deux réservoirs d'entrée.
    3. Acquérir l'image de fluorescence de FITC-Dextran dans le canal à gradient.
    4. Importez l'image au logiciel ImageJ à l'aide de la commande "Fichier | Ouvrir".
    5. Mesurez le profil d'intensité de fluorescence sur le canal dégradé en utilisant la commande "Analyse | Profil de tracé".
    6. Exportez les données de mesure dans une feuille de calcul pour un traçage supplémentaire.
    7. Incuber l'appareil sur le stade du microscope à température contrôlée ou dans un incubateur de culture cellulaire classique pendant 15 min.
    8. Image le canal dégradé à l'aide d'un objectif 10X pour enregistrer les positions finales des cellules pour l'analyse des données.
    9. Si nécessaire, enregistrez la migration de la cellule dans l'appareil par microscopie temporelle.

4. Cell Migration DAta Analysis ( Figure 1C )

  1. Analyser le dosage de chimiotaxis en calculant la distance de migration cellulaire de la structure d'amarrage comme décrit ci-dessous. Voir la figure 1C .
  2. Importez l'image dans le logiciel NIH ImageJ (version 1.45).
  3. Sélectionnez le centre de chaque cellule qui se déplace dans le canal dégradé.
  4. Mesurez les coordonnées des cellules sélectionnées pour leurs positions finales. Mesurez la coordonnée d'un point au bord de la structure d'ancrage en tant que position de référence initiale.
  5. Exportez les données de coordonnées mesurées vers une feuille de calcul ( ex. Excel). Calculez la distance de migration des cellules comme la différence entre la position finale d'une cellule et la position de référence initiale le long du sens de gradient.
  6. Calibrer la distance à un micromètre. Calculez la moyenne et l'écart de la distance de migration de toutes les cellules en tant que mesure de la chimiotaxis.
  7. Comparez le migDistance de la ration en présence d'un gradient de chimioattractant à l'expérience de contrôle moyen en utilisant le test t de Student.
  8. Si les images temporelles de la migration cellulaire sont enregistrées, la migration cellulaire et la chimiotaxie peuvent être analysées plus avant par analyse de suivi des cellules 15 .
    REMARQUE: Les matériaux nécessaires à la construction et à l'exécution du test de chimiotaxie sur toute la puce sont détaillés dans le tableau des matériaux.

Résultats

Les neutrophiles sont sélectionnés négativement à partir d'une goutte de sang total directement dans le dispositif microfluidique. La pureté des neutrophiles isolés a été vérifiée par la coloration Giemsa sur puce et les résultats ont montré les noyaux typiques en forme d'anneau et de lobe des neutrophiles ( Figure 2A ) 25 . Ceci indique une isolation efficace des neutrophiles sur puce à haute pureté à partir d&...

Discussion

Dans cet article, un protocole détaillé pour isoler directement les neutrophiles du sang total suivi du test de chimiotaxis, tout sur une seule puce microfluidique, a été décrit. Cette méthode offre des fonctionnalités utiles dans son opération simple, la sélection négative de neutrophiles de haute pureté, le test de chimiotaxie rapide d'échantillon à résultat, les réactifs réduits et la consommation d'échantillon, ainsi qu'une analyse précise des données de migration cellulaire. À titre ...

Déclarations de divulgation

Il n'y a aucun conflit d'intérêt à divulguer.

Remerciements

Ce travail bénéficie en partie de subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Nous remercions l'Institut clinique de recherche appliquée et d'éducation à l'Hôpital général de Victoria à Winnipeg et à Seven Oaks General Hospital à Winnipeg pour la gestion d'échantillons cliniques de sujets humains. Nous remercions le Dr Hagit Peretz-Soroka pour une discussion utile sur les stratégies d'opération de dosage. Nous remercions le Professeur Carolyn Ren et le Dr Xiaoming (Cody) Chen de l'Université de Waterloo pour leur soutien généreux au processus de tournage.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Device fabrication
Mask alignerABMN/A
SpinnerSolitec5000
HotplateVWR11301-022
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001
Vacuum dessicatorFisher Scientific08-594-15A
Digital scaleOhausCS200
SU-8 2000 thinnerMicrochemSU-8 2000
SU-8 2025 photoresistMicrochemSU-8 2025
SU-8 developerMicrochemSU-8 developer
Si waferSilicon, IncLG2065
isopropyl alcoholFisher ScientificA416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilaneGelest78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)		Ellsworth Adhesives2065622
Petri DishFisher ScientificFB0875714
Glass slidesFisher Scientific12-544-4
Cutting padN/AN/ACustom-made
PunchersN/AN/ACustom-made
Name SourceCatalog NumberComments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640Fisher ScientificSH3025502
DPBSFisher ScientificSH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)		Sigma-AldrichSH3057402
FibronectinVWRCACB356008
fMLPSigma-AldrichF3506-10MG
Magnetic disksIndigo Instruments44202-15 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-DextranSigma-AldrichFD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich		R4127-5G
Giemsa stain solutionRowley Biochemical Inc.G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit		STEMCELL
Technologies Inc		19666
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope NikonTi-U
Microscope environmental chamber.InVivo ScientificN/A
CCD cameraNikonDS-Fi1

Références

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